C35對胃癌細(xì)胞侵襲性的影響*

詹遠(yuǎn)京，牛立志，徐克成，穆峰，施娟娟

（廣州復(fù)大腫瘤醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510305）

·論著·

C35對胃癌細(xì)胞侵襲性的影響*

詹遠(yuǎn)京，牛立志，徐克成，穆峰，施娟娟

（廣州復(fù)大腫瘤醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510305）

目的了解C35基因在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，探討C35基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、BGC-823、HGC-27及正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1，以實時定量PCR檢測胃癌細(xì)胞株及正常胃黏膜細(xì)胞株中C35的表達(dá)水平；使用小片斷干擾RNA（siRNA）下調(diào)胃癌細(xì)胞株C35的表達(dá)；實時定量PCR及免疫印跡檢測干擾前后C35 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的變化；MTT法和體外Matrigel侵襲實驗觀察C35減敲后胃癌細(xì)胞株生長能力和侵襲能力的改變。結(jié)果C35在胃癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，而在正常胃黏膜細(xì)胞中不表達(dá)；經(jīng)C35特異的siRNA作用后，C35 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下降；減敲C35后，胃癌細(xì)胞株的生長能力和侵襲能力顯著降低。結(jié)論C35在胃癌細(xì)胞株中特異性高表達(dá)，C35在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。

C35；胃癌；基因干擾

2006年，EVANS等[1]通過扣除雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一種在乳腺癌細(xì)胞中普遍存在且特異性高表達(dá)，而在正常乳腺組織中不表達(dá)的新基因C35。C35基因位于人染色體17q12，在Her-2/neu的擴(kuò)增子上，位于Her-2/neu和GRB7之間，編碼12 kDa的膜固定蛋白。通過免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，60%以上的乳腺癌患者可檢測到C35基因在所有癌癥發(fā)展階段均存在穩(wěn)定的過表達(dá)現(xiàn)象。DASGUPTA等[2]研究發(fā)現(xiàn)，C35蛋白在前列腺癌細(xì)胞中可促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和浸潤。

胃癌缺乏理想的腫瘤標(biāo)志基因和分子靶向藥物。本研究以人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、BGC-823及HGC-27為實驗組，以正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1作為對照，比較胃癌細(xì)胞株與正常胃黏膜細(xì)胞株之間C35的表達(dá)差異，初步探討C35基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

SGC-7901、BGC-823、HGC-27購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，GES-1購自上海消化系疾病研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基購自GibcoTM公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶購自Amresco公司，C35特異性siRNA、羊抗人C35抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊二抗抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，Trizol試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，Real time聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增試劑盒購自美國Gene Copoeia公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Transwells小室購自COSTAR公司，基底膜基質(zhì)Matrigel購自Beeton Dickinson公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞株置于10 ml含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%二氧化碳CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中貼壁生長。約3～5 d換液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底75%面積時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.3實時定量PCR

按Trizol說明書中步驟提取各實驗細(xì)胞株的總RNA，取RNA 1μg按說明書方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于后續(xù)PCR反應(yīng)。用ABI 7500熒光定量PCR儀和SYBR Green I染料混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性1 min，40個循環(huán)93℃變性30 s、55℃退火45 s，72℃延伸30 s，然后從72～95℃建立熔解曲線。以ABI 7500 Software v2.0.6讀取PCR反應(yīng)結(jié)果。C35為目的基因，正向引物序列：5'-GAGATAAATGGACAGCTGGTGTTCT-3'；反向引物序列：5'-CGGCTGTTGGTGATCTTTTCTA-3'。以GAPDH為內(nèi)參，正向引物序列：5'-CCTGCACCACC AACTGCTTAG-3'；反向引物序列：5'-CAGTCTTCTG GGTGGCAGTGA-3'。實時定量PCR結(jié)果以Ct值表示，△Ct為同一樣本中內(nèi)參與目的基因Ct值之差，采用2-△△Ct相對定量分析方法比較目的基因在實驗和對照樣品間的表達(dá)差異。

1.4siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天將1.0×105對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.5 ml的培養(yǎng)基，以10μmol/L濃度的siRNA進(jìn)行基因干擾實驗。第2天按照LipofectamineTM2000說明書的常規(guī)方法配制轉(zhuǎn)染試劑，每孔使用DNA 0.8μg、轉(zhuǎn)染試劑2.0μl，轉(zhuǎn)染3～5 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集樣本，通過實時定量RT-PCR方法檢測C35基因的mRNA表達(dá)水平。

1.5Western blot

采用化學(xué)發(fā)光（ECL法）技術(shù)進(jìn)行C35蛋白檢測。收集各組細(xì)胞后超聲破碎，取適量進(jìn)行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；羊抗人C35抗體作為一抗，GAPDH作為對照。

1.6MTT實驗

收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，鋪板使細(xì)胞密度調(diào)至103～104個/孔。5%二氧化碳CO2，37℃條件下孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。轉(zhuǎn)染siRNA后孵育48 h進(jìn)行MTT檢測。

1.7細(xì)胞體外浸潤實驗

取300μl無血清培養(yǎng)基，加入60μl Matrigel混勻，加入上室各100μl（3個室），37℃孵育5 h使其呈凝膠狀；上室加入無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞100μl，下室內(nèi)加入完全培養(yǎng)基500μl；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)24 h；取出小室，吸棄上室液體，用棉簽仔細(xì)擦凈膜上未侵襲的細(xì)胞以及人工基底膠膜，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，加入結(jié)晶紫染色；顯微鏡下計數(shù)浸潤到小室背面的細(xì)胞，200倍光鏡隨機(jī)選擇5個視野計數(shù)，取平均值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，兩組以上均數(shù)比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胃癌細(xì)胞株中C35的表達(dá)

實時定量PCR檢測C35基因在3株胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜細(xì)胞株中mRNA表達(dá)水平。熔解曲線具有單峰特異性，正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1中未檢出C35基因，HGC-27和BGC-823中C35的表達(dá)分別是SGC-7901的1.47倍和1.58倍。Western blot檢測C35蛋白在4種細(xì)胞株中的表達(dá)，3種胃癌細(xì)胞株均表達(dá)，GES-1無明顯表達(dá)。見圖1。

圖1 C35在GES-1、HGC-27、BGC-823和SGC-7901細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2siRNA轉(zhuǎn)染后C35的表達(dá)

與陰性對照組比較，實時定量PCR結(jié)果顯示24 h后HGC-27、BGC-823和SGC-7901細(xì)胞株中目的基因C35的抑制效率分別為：84.40%、89.20%和93.34%。與空白對照比較，HGC-27、BGC-823及SGC-7901中C35的表達(dá)水平分別是：0.007480、0.010315和0.004432。ECL方法顯示siRNA轉(zhuǎn)染24 h后C35的蛋白表達(dá)明顯受抑制。見圖2和3。

圖2 siRNA基因減敲后C35在GES-1和HGC-27的表達(dá)

圖3 siRNA基因減敲后C35在BGC-823和SGC-7901的表達(dá)

2.3siRNA轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞株的增殖水平

MTT檢測顯示，siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，胃癌細(xì)胞株HGC-27、BGC-823和SGC-7901在酶標(biāo)儀490 nm處測量吸光光度值分別為：（0.325±0.011）、（0.235±0.019）和（0.330±0.034），方差分析結(jié)果顯示每種胃癌細(xì)胞株siRNA干擾組、未受干擾組、陰性對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），LSD法結(jié)果顯示3種胃癌細(xì)胞株siRNA干擾組吸光光度值均顯著小于其他兩組（均P＜0.001），siRNA轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞株的增殖能力明顯降低。見圖4。

圖4 siRNA基因減敲后細(xì)胞株的增殖水平

2.4siRNA轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞株的侵襲能力

HGC-27細(xì)胞株siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過人工基底膜的平均細(xì)胞數(shù)為（13.0±2.3）個，顯著少于陰性對照組（53.0±7.8）個（t檢驗，P＜0.001）及空白對照組的（58.0±10.7）個（P＜0.001）；BGC-823細(xì)胞株siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過人工基底膜的平均細(xì)胞數(shù)為（5.0±1.8）個，顯著少于陰性對照組（45.0±8.1）個（P＜0.001）及空白對照組的（49.0±7.3）個（P＜0.001）；SGC-7901細(xì)胞株siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過人工基底膜的平均細(xì)胞數(shù)為（5.0±2.0）個，顯著少于陰性對照組（13.0±2.6）個（P＜0.001）及空白對照組的（15.0± 2.7）個（P＜0.001）。

3 討論

以往研究證實[3-4]，20%～40%乳腺癌患者存在Her-2/neu過度表達(dá)。有研究通過免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，60%以上的乳腺癌患者可檢測到C35基因在所有癌癥發(fā)展階段均存在穩(wěn)定的過表達(dá)現(xiàn)象，表達(dá)量和穩(wěn)定性均明顯高于Her-2/neu基因。所有Her-2/ neu基因高表達(dá)的病例均有C35基因高表達(dá)，但尚未檢測到Her-2/neu基因表達(dá)陽性而C35基因表達(dá)陰性的乳腺癌病例，表明C35基因在乳腺癌細(xì)胞的過表達(dá)更常見、范圍更廣，其功能可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系更為密切。巴再華等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著乳腺癌組織的TNM分期、病理組織學(xué)分級的增加，C35蛋白陽性率顯著升高。C35被認(rèn)為是一種新型乳腺癌標(biāo)志基因，尤其適用于乳腺癌早期階段的預(yù)測和診療。

胃癌中也存在Her-2/neu的過度表達(dá)。采用單克隆抗體的ICH法檢測Her-2/neu表達(dá)的研究表明，胃癌中Her-2/neu的過表達(dá)率為6%～45%，BANG等[6]在大樣本量的一個研究（3 883例胃癌患者）中得到Her-2/neu的過表達(dá)率為22.9%。胃癌的基礎(chǔ)和臨床研究顯示，Her-2/neu在部分胃癌患者中過表達(dá)，是一個預(yù)后不良因素，曲妥珠單抗作為針對Her-2/neu的分子靶向藥物，將其聯(lián)合化療可改善總生存率，取得了較好的療效[7]。通過靶向藥物抑制Her-2/neu基因過度表達(dá)來治療胃癌的局限性在于：Her-2/neu過表達(dá)在胃癌患者中所占比例有限，且即使是Her-2/neu過表達(dá)患者，仍有超過50%患者未獲治療反應(yīng)[8]。

本研究以胃癌細(xì)胞HGC-27、BGC-823、SGC-7901及正常胃黏膜細(xì)胞GES-1為對象，結(jié)果表明C35在分化程度不同的胃癌細(xì)胞株中均呈高表達(dá)水平，而在正常胃黏膜細(xì)胞中不表達(dá)，初步證實C35可能是理想的胃癌細(xì)胞診斷的標(biāo)志分子。將C35特異的siRNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞后，C35的抑制率較高蛋白表達(dá)明顯受抑制，癌細(xì)胞的侵襲能力顯著下降，表明C35可成為理想的胃癌治療靶基因。

C35蛋白的致癌性與ITAM motif（一種在逆轉(zhuǎn)錄病毒中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域）[9]存在直接關(guān)聯(lián)。KATZ等[10]發(fā)現(xiàn)，C35基因在正常細(xì)胞中處于失活狀態(tài)，過表達(dá)后會通過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間葉細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因E-cadherin和keratin-8的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)趨向紡錘型，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。HSU等[11]通過研究C35蛋白的空間結(jié)構(gòu)，提出C35可能依靠具有氧化還原活性的超二級結(jié)構(gòu)而在AKT磷酸化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。隨著機(jī)制研究的不斷深入和靶向藥物的加速研發(fā)，相信C35會為胃癌的診斷與治療產(chǎn)生巨大推動作用。

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（張立芳 編輯）

Effect of C35 on invasion of gastric cancer cell lines*

Yuan-jing ZHAN,Li-zhi NIU,Ke-cheng XU,Feng MU,Juan-juan SHI
(Department of Oncology,Fuda Cancer Hospital at Guangzhou, Guangzhou,Guangdong 510305,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of C35 in gastric cancer cell lines,and the effect of C35 on carcinogenesis and development of gastric cancer.【Methods】Human gastric cancer cell lines,including SGC-7901,BGC-823,HGC-27,and human gastric epithelial cell line GES-1,were cultured.The expression of C35 in gastric cancer cells and human gastric epithelial cells were detected by real-time PCR.We perturbed C35 gene expression using short interfering RNA molecules(siRNAs)and then investigated the changes of C35 gene expression before and after the interference using Western blots and RT-PCR.The proliferative and invasive abilities were detected by MTT colorimetry and Matrigel invasion assays.【Results】C35 was positively expressed in gastric cancer cell lines,while negatively expressed in normal gastric epithelial cells.After gene transfection,the expression level of C35 decreased notably.The proliferative and invasive abilities were obviously inhibited in gastric cancer cells in which C35 gene had been"knocked out".【Conclusion】C35 can over express in human gastric cancer cell lines and enhance the growth ability of gastric cancer cells.

C35;gastric cancer;RNA interference

R735.7

A

1005-8982（2015）25-0008-04

2015-01-18

中國科學(xué)院再生生物學(xué)重點(diǎn)實驗室開放課題（No：KLRB201219）