人肝再生增強因子基因慢病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定＊

薛 峰，王伯慶，尹繼煒，易 超

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽胰外科（烏魯木齊 830011）

改善肝部分切除術(shù)后余肝再生能力一直是困擾肝臟外科醫(yī)生的難題。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，肝細胞損傷修復過程的分子生物學機制研究逐步成為肝臟基礎(chǔ)研究的核心內(nèi)容。肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration，ALR）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高表達于肝細胞中的特異性分裂原，在肝細胞損傷修復過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1－2］。本研究通過構(gòu)建攜帶人ALR基因的慢病毒表達載體，并轉(zhuǎn)染BLR 3A大鼠肝細胞驗證其安全性與有效性，以期為深入研究ALR在肝再生過程中的作用機制奠定良好的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PCR擴增試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；ALR PCR擴增引物由生工生物工程（上海）有限公司設計合成；SacⅡ限制性內(nèi)切酶、大量質(zhì)粒提抽試劑盒、dNTP、Taq DNA 聚合酶、1Kb plus DNA Marker、T4連接酶購自NEB公司；pCDALR由深圳大學附屬羅湖區(qū)人民醫(yī)院李海軍教授惠贈；中間克隆載體pUC57、pLenti6/V5－D－TOPO重組慢病毒載體、ViraPowerTMPackaging Mix慢病毒包裝體系、病毒定量引物、TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；BLR 3A大鼠肝細胞、Top10化學感受態(tài)細胞與293T病毒包裝細胞由中國科學院上海細胞庫提供；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；兩部法反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、Trizol試劑盒購自北京天恩澤生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、LB培養(yǎng)基、OptiMEM培養(yǎng)基、SDSPAGE凝膠制備試劑盒購自Gibco公司；多功能凝膠電泳槽、96孔梯度PCR儀、CO2細胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、NU－437－400E型生物安全柜、－80℃低溫冰柜及PBS緩沖液等常用分子生物化學試劑由新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 ALR基因擴增與檢測 根據(jù)GenBank提供的人ALR基因全長信息，設計PCR擴增引物，以人胎肝cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物與pCD－ALR質(zhì)粒（陽性對照，成功合成的ALR基因片段載體）酶切產(chǎn)物共同電泳對比鑒定，利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測序驗證。將擴增得到經(jīng)驗證無誤的ALR基因片段平端連接入pUC57載體后，轉(zhuǎn)染Top10化學感受態(tài)細胞，37℃倒置培養(yǎng)過夜，次日擴大培養(yǎng)生長較好的菌落2h后行PCR菌檢，利用大量質(zhì)粒提抽試劑盒提取陽性克隆質(zhì)粒（pUC57－ALR）行測序鑒定。ALR基因PCR擴增引物，上游引 物：5′－GCGGAATTCGCAACGGAATGCGGA CCCACCAGAAGCGGGAC－3′；下游引物：5′－GCT GGATCCTTAGTCACAGGAGGCGTCCTTCC－3′。

1.2.2 構(gòu)建pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質(zhì)粒 將含有與GenBank提供的人ALR基因信息相吻合的ALR基因片段的pUC57－ALR質(zhì)粒與pLenti6/V5－D－TOPO載體用SacⅡ限制性內(nèi)切酶酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染Top10化學感受態(tài)細胞，37℃倒置培養(yǎng)過夜，次日同前法行PCR菌檢后SacⅡ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，鑒定無誤的陽性克隆提抽質(zhì)粒送測序后，－80℃凍存。

1.2.3 慢病毒包裝 培養(yǎng)293T細胞至對數(shù)生長期后，行胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，293T細胞按5×106個/mL濃度鋪10cm板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞生長到90%匯合度后，培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。用OptiMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次后，將293T細胞加入5mL OptiMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20min。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將5μg LipofectamineTM2000 與 10 μg ViraPowerTMPackaging Mix、5 μg pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質(zhì) 粒 混 合 后，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20min。加入孵育后的293T細胞中培養(yǎng)8h，去除培養(yǎng)基，并用PBS緩沖液沖洗細胞3次。加入DMEM培養(yǎng)基25mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。完成轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下觀察293T細胞熒光蛋白表達情況，評價轉(zhuǎn)染效果，確定轉(zhuǎn)染成功后，收集培養(yǎng)瓶內(nèi)上清液，4℃、離心15min（離心半徑20cm，轉(zhuǎn)速4 000r/min），上清液0.45μm微孔濾膜過濾。相同條件下再次離心15min，上清液即為病毒濃縮液，分裝后－80℃凍存。

1.2.4 病毒滴度測定 TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒提取250μL病毒液RNA后，稀釋至30μL，取2μL RNA以101～1 011copies/μL的pLenti6質(zhì)粒作為標準樣品，進行實時定量PCR檢測測定病毒滴度。

1.2.5 攜帶人ALR基因慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染BLR 3A大鼠肝細胞 BLR 3A大鼠肝細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，行胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，同前293T細胞鋪10cm板培養(yǎng)24h至90%匯合度。37℃預熱的0.01mol/L PBS緩沖液沖洗細胞3次后，加入2mL DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20min。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，加入500μL病毒液與10μg LipofectamineTM2000，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育72h后，觀察BLR 3A大鼠肝細胞生長情況及熒光蛋白表達情況。

1.2.6 RT－PCR法檢測BLR3A大鼠肝細胞人ALR基因表達 上述轉(zhuǎn)染72h的BLR 3A大鼠肝細胞，取1×107個細胞胰蛋白酶消化后，采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA。參照兩步法RTPCR試劑盒說明書，檢測人ALR基因表達，反應參數(shù)設定為：95 ℃、5min；94 ℃、30s；52 ℃、40s；72℃、30s；72℃、7min；28個循環(huán)，內(nèi)參照β－actin。以加入空慢病毒載體與等量PBS緩沖液的BLR 3A大鼠肝細胞為對照。ALR基因PCR擴增引物，上游引物：5′－GCGGAATTCGCAACGGAATGCGG ACCCACCAGAAGCGGGAC－3′；下游引物：5′－GC TGGATCCTTAGTCACAGGAGGCGTCCTTCC－3′。

2 結(jié)果

2.1 ALR基因擴增電泳檢測

擴增的目的基因與pCD－ALR質(zhì)粒中ALR基因片段位置一致，均位于 Marker的300～400bp，與GenBank報道ALR基因長度（378bp）一致（圖1）。

圖1 ALR基因與pCD－ALR質(zhì)粒酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質(zhì)粒酶切電泳檢測

經(jīng)酶切后獲得大小約7 000bp（慢病毒表達載體質(zhì)粒）和378bp兩個條帶，證實ALR基因片段成功插入pLenti6/V5－D－TOPO載體中（圖2）。

2.3 基因測序

擴增產(chǎn)物、pUC57－ALR質(zhì)粒與pLenti6/V5－DTOPO－ALR質(zhì)粒酶切后測序結(jié)果經(jīng)DNAStarSeqMan軟件分析顯示，合成的ALR基因與GenBank報道一致，無堿基錯排、缺失與突變。

圖2 pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質(zhì)粒酶切電泳圖

2.4 病毒滴度及慢病毒包裝293T細胞熒光蛋白表達

實時定量PCR測得病毒滴度為1.48×107v.p./mL。慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞72h后熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達情況，轉(zhuǎn)染率為92.31%，培養(yǎng)72h過程中僅有少量細胞出現(xiàn)病變脫落（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染293T細胞72h后熒光顯微鏡下觀察（×100）

2.5 構(gòu)建的攜帶人ALR基因慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染BLR 3A大鼠肝細胞

轉(zhuǎn)染后72h培養(yǎng)過程中，僅少量BLR 3A細胞發(fā)生病變脫落，熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染率達88.49%。RT－PCR電泳結(jié)果顯示，僅人ALR慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染的BLR 3A大鼠肝細胞表達人ALR基因，加入空慢病毒載體與等量PBS緩沖液的BLR 3A大鼠肝細胞均未見有陽性表達條（圖4～5）。

圖4 BLR 3A大鼠肝細胞轉(zhuǎn)染72h后熒光顯微鏡下觀察（×100）

圖5 BLR 3A細胞RT－PCR凝膠電泳照片

3 討論

由于肝臟外科技術(shù)的飛速發(fā)展，肝部分切除或肝移植術(shù)后，肝臟再生能力及其調(diào)控機制逐步成為肝臟基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的核心問題。目前已知與肝臟再生相關(guān)的因子超過百種，但多數(shù)不具有肝臟特異性［3］。ALR是近年發(fā)現(xiàn)的一種在肝細胞內(nèi)高度表達且高效促肝細胞增殖的分裂原，其在肝臟損失修復過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1－2］。

ALR由Hagiya等［4］于1994年在大鼠肝組織中發(fā)現(xiàn)，隨后學者們依據(jù)大鼠ALR基因擴增引物，利用PCR技術(shù)從人胎肝中篩選成功獲得人ALR cDNA克隆。ALR在促進肝細胞增殖方面的高效性已成為共識。最近，Tang等［5］研究顯示，在膽道梗阻誘導的急性黃疸性肝炎模型中，ALR可顯著促進肝細胞的增殖，以加速受損肝臟的修復。Wang等［6］研究顯示，ALR在大鼠肝移植模型肝臟損傷修復中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，外源性重組ALR可明顯加速移植肝臟組織的生長，并有效提高大鼠生存率。上述研究證實了ALR在肝臟損傷修復過程中的關(guān)鍵性作用，但其機制尚不明確。為深入研究ALR基因在肝臟部分切除后余肝再生中作用機制，本研究采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了攜帶ALR基因的慢病毒表達載體，并通過電泳、酶切鑒定及基因測序分析的方法證實了其準確性，為進一步研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

無論是基因功能的研究還是基因治療的實現(xiàn)，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是如何選擇合適載體。理想的載體既要保證實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移，又可使目的基因得到穩(wěn)定表達，同時還可兼顧安全性。慢病毒表達載體是一種來源于人類免疫缺陷病毒－1的新型病毒載體，具有高效轉(zhuǎn)染能力，目前已廣泛用于分子生物化學研究的各個領(lǐng)域［7－10］。安全性方面，選擇與病毒載體成分不同源的包裝體系即可防止其恢復為野生免疫缺陷病毒－1，從而避免致病的可能［11］。與以往常用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體相比，慢病毒載體具有可感染處于分裂期和非分裂期細胞，可連接基因片段長，可實現(xiàn)基因穩(wěn)定表達且免疫反應小等優(yōu)點［12－15］。

本研究采用酶切連接的方法成功構(gòu)建了攜帶目的基因的慢病毒表達載體，保證了目的基因插入方向的準確性，防止反義基因的表達。轉(zhuǎn)染BLR 3A大鼠肝細胞的過程中，僅有少部分大鼠肝細胞發(fā)生脫落壞死，轉(zhuǎn)染率達88.49%，且RT－PCR結(jié)果顯示，被轉(zhuǎn)染的大鼠肝細胞可穩(wěn)定表達ALR基因。研究結(jié)果證實，慢病毒表達載體是用于基因研究乃至基因治療的理想載體，兼具安全性與有效性。但值得注意的是，本研究中獲得的慢病毒滴度僅為1.48×107v.p./mL，尚不足以應用于臨床研究，其臨床應用的安全性也需深入研究證實。

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