銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的研究

楊 彬，沈樹(shù)安，陳盛瓊，李之令

1.涼山州第二人民醫(yī)院 肛腸科（西昌 615000）；2.新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊 830000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種人類(lèi)常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤［1］，其發(fā)生發(fā)展受染色體異常和基因突變等多因素調(diào)控，由于晚期惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，發(fā)病率和病死率均較高［2］。目前，CRC的治療主要采取手術(shù)切除并輔以結(jié)直腸癌靶向藥物，如奧沙利鉑等，但CRC切除患者易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且分子靶向藥物仍存在較強(qiáng)的毒副作用［3］，因而篩選有價(jià)值的低毒有效的中草藥成分是輔助CRC手術(shù)治療的有效選擇。銀杏葉又名白果葉，具有化濕止瀉、益心斂肺和治療胸悶心痛等功效［4］。銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）是從銀杏葉提取的二萜類(lèi)化合物［5］，姜偉等［6］發(fā)現(xiàn)，GB能夠顯著增加耐藥卵巢癌細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性，可作為一種臨床腫瘤化療過(guò)程中的輔助性藥物。有研究［7］進(jìn)一步表明，GB進(jìn)入癌細(xì)胞后可被代謝為小分子化合物，可能通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體融合，誘導(dǎo)凋亡因子的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。提示GB可能對(duì)人CRC細(xì)胞具有潛在的抗癌作用。本研究通過(guò)制備HCT116裸鼠瘤動(dòng)物模型，觀(guān)察GB對(duì)CRC生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人CRC細(xì)胞增殖抑制率，觀(guān)察其細(xì)胞形態(tài)和凋亡情況，探討GB對(duì)人CRC細(xì)胞增殖和凋亡影響，并采用 Western blot法對(duì)人CRC HCT116 細(xì) 胞 內(nèi) Bcl－2 蛋 白（B－cell leukemia/lymphoma 2，Bcl－2）、Bax 蛋 白（Bcl－2－associated protein x，Bax）和線(xiàn)粒體融合蛋白1（mitofusin 1，Mfn1）的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在揭示GB促進(jìn)人CRC細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，以期為人CRC的治療提供新的中草藥輔助治療手段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

人CRC細(xì)胞系HCT116購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)HCT116細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，傳代后接種于培養(yǎng)板中，分為4組，分別為陰性對(duì)照組（無(wú)藥物處理）和GB處理組（終質(zhì)量濃度分別為1、5、25mg/L），不同質(zhì)量濃度的 GB處理細(xì)胞72h，每組做3個(gè)平行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～5 周齡雌性BALB/c系裸鼠20只，體質(zhì)量20～30g，購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（川）2014～10。

1.3 藥物及主要試劑、儀器

GB購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。胎牛血清、雙抗和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司，Giemsa染色劑購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司，Annexin V－FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL顯色試劑購(gòu)自R＆D公司，Bcl－2、Bax和Mfn1兔源一抗購(gòu)自美國(guó)NovusBiologicals公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自成都寶信生物科技有限公司，ELx酶標(biāo)儀由美國(guó)Bio－Tek Instruments Inc公司生產(chǎn)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由德國(guó)Heidolph公司生產(chǎn)，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀由上?？∈松锟萍加邢薰旧a(chǎn)，流式細(xì)胞儀由美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)。

1.4 CRC裸鼠模型及處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HCT116細(xì)胞200μL（含5×105個(gè)癌細(xì)胞）接種于20只裸鼠左腋皮下，1周后皮下實(shí)體瘤形成，隨機(jī)分為4組，即陰性對(duì)照組（僅注射 DMSO）、低劑量組（5mg/kg）、中劑量組（10mg/kg）和高劑量組（20mg/kg），每組5只。裸鼠腹腔注射15μL DMSO 和5、10、20mg/kg GB，注射7次/周，共4周。觀(guān)察各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，同時(shí)每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組裸鼠腫瘤的長(zhǎng)徑與短徑，計(jì)算腫瘤的體積［4π/3×（短徑/2）2×（長(zhǎng)徑/2）］［8］，并在注射第4周時(shí)，比較各組腫瘤質(zhì)量的差異。

1.5 MTT法檢測(cè)GB對(duì)人CRC細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人CRC細(xì)胞HCT116接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞密度為2×103個(gè)，培養(yǎng)24h后，藥物處理組分別加入不同質(zhì)量濃度的GB（終質(zhì)量濃度為1、5、25mg/L），陰性對(duì)照組每孔僅加入RPMI 1640培養(yǎng)液，另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組（含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞）。37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)72h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，搖床上震搖10min，酶標(biāo)儀測(cè)570nm處各孔吸光度（A）值，每孔吸A值減去陰性對(duì)照孔A值即為各測(cè)試孔的實(shí)際A值。計(jì)算人CRC細(xì)胞增殖抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值）×100%。每組重復(fù)3次。

1.6 Giemsa染色觀(guān)察CRC細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人CRC細(xì)胞HCT116，藥物處理組分別給予不同質(zhì)量濃度的GB（終質(zhì)量濃度為1、5、25mg/L）處理72h，酶消化后用滅菌PBS清洗3次，進(jìn)行涂片和固定，Giemsa染色后觀(guān)察人CRC細(xì)胞及其核的變化。

1.7 Annexin V/PI雙染法觀(guān)察CRC細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人CRC細(xì)胞HCT116接種于24孔板，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24h后，藥物處理組分別給予不同質(zhì)量濃度的GB（終質(zhì)量濃度為1、5、25mg/L）處理72h，陰性對(duì)照組僅加入RPMI 1640培養(yǎng)液。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，4℃，以離心半徑3cm，2 000r/min，離心5min，收集細(xì)胞。預(yù)冷滅菌PBS重懸浮細(xì)胞，4℃，以離心半徑3cm，2 000r/min，離心5min，棄上清，洗3次。加入300μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，加入5μL的 Annexin V－FITC 混勻，避光，室溫孵育15min，上機(jī)前5min，再加入5μL的PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，BD FACS Diva software v6.1.3 軟件分析HCT116細(xì)胞的凋亡結(jié)果。

1.8 Western blot法檢測(cè)Bcl－2、Bax和 Mfn1的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人CRC細(xì)胞HCT116接種于6孔板，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24h后，藥物處理組分別給予不同質(zhì)量濃度的GB（終質(zhì)量濃度為1、5、25mg/L）處理72h，陰性對(duì)照組僅加入RPMI 1640培養(yǎng)液。收集各組細(xì)胞后提取總蛋白并定量，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，電印跡轉(zhuǎn)移法將膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至纖維素膜，5%脫脂奶粉液搖床封閉2h，4℃，過(guò)夜孵育Bcl－2、Bax和 Mfn1一抗（稀釋度1∶1 000），TBST洗膜6次，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋度1∶5 000）搖床孵育2h，TBST洗膜6次，ECL法顯色，曝光，暗室中洗片，掃描后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 GB抑制裸鼠HCT116移植瘤的生長(zhǎng)（±s）

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）描述，各處理組與對(duì)照組之間比較采用Dunnett－t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 GB抑制裸鼠HCT116移植瘤的生長(zhǎng)

腹腔注射GB 1周后，GB對(duì)移植瘤的體積無(wú)明顯影響，然而隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，不同劑量的GB均能夠抑制移植瘤的生長(zhǎng)（P＜0.05）。不同劑量的GB處理移植瘤4周后，GB能夠顯著降低移植瘤的質(zhì)量（P＜0.05）（圖1）。

2.2 GB抑制人CRC細(xì)胞增殖

細(xì)胞活性分析結(jié)果顯示，1mg/L與5mg/L的GB對(duì)人CRC細(xì)胞的增殖抑制率無(wú)明顯影響，25mg/L的GB能夠顯著提高人CRC細(xì)胞的增殖抑制率（P＜0.01）（圖2）。

2.3 GB對(duì)人CRC細(xì)胞形態(tài)的影響

Giemsa染色結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度（終質(zhì)量濃度為1、5、25mg/L）的GB處理HCT116 72h后，5mg/L的GB可輕微導(dǎo)致HCT116細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)較少多核、核碎裂細(xì)胞及凋亡小體。25mg/L的GB能夠?qū)е麓蟛糠諬CT116細(xì)胞凋亡，多核、核碎裂細(xì)胞以及凋亡小體出現(xiàn)較多（圖3）。

2.4 GB對(duì)人CRC細(xì)胞凋亡的影響

不同質(zhì)量濃度的GB作用HCT116細(xì)胞72h后，隨著GB濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。1mg/L的GB組，細(xì)胞凋亡率為3.2%；5mg/L的GB組，細(xì)胞凋亡率為5.4%；25mg/L的GB組，細(xì)胞凋亡率為47.8%（圖4）。

圖2 GB對(duì)人CRC細(xì)胞增殖的影響（±s）

圖3 GB對(duì)人CRC細(xì)胞形態(tài)的影響（Giemsa×100）

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GB對(duì)人CRC細(xì)胞凋亡的影響

2.5 GB對(duì)人CRC細(xì)胞Bcl－2、Bax和 Mfn1蛋白表達(dá)的影響

不同質(zhì)量濃度的GB作用HCT116細(xì)胞72h后，隨著GB濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上升，Mfn1表達(dá)下降。5mg/L和25mg/L的GB能夠降低人CRC細(xì)胞HCT116Bcl－2蛋白的表達(dá)（P＜0.05）；25mg/L的GB能夠升高人CRC細(xì)胞HCT116Bax蛋白的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)顯著降低人CRC細(xì)胞HCT116 Mfn1蛋白的表達(dá)（P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性（圖5）。

3 討論

CRC是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，手術(shù)切除后殘存的腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)異常增殖，可破壞病變周?chē)恼＝M織或器官，患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的幾率高于50%［9］。因而，及時(shí)對(duì)其進(jìn)行手術(shù)切除并尋求具有抗癌細(xì)胞增殖的中草藥對(duì)CRC患者的后期治療具有重要意義。研究［10－11］發(fā)現(xiàn)，二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物能夠通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，具有較好的抗腫瘤活性。GB是銀杏葉提取物種生理活性最強(qiáng)的二萜類(lèi)化合物，含有3個(gè)內(nèi)酯環(huán)，能夠用于防治轉(zhuǎn)移性癌癥［12］。Jiang等［13］研究表明，GB能夠增加耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，可用于臨床惡性腫瘤的治療。因此，推測(cè)GB有可能通過(guò)促進(jìn)人CRC細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而輔助性治療人CRC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GB能夠抑制裸鼠瘤的生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，與上述結(jié)論相符，表明GB能夠抑制人CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。Hsuuw等［14］發(fā)現(xiàn)，GB可誘導(dǎo)胚囊細(xì)胞凋亡，抑制胚囊細(xì)胞增殖，提示GB具有一定的促凋亡作用。同時(shí)，De Feudis等［15］顯示，GB能夠高度抑制人胸腺癌細(xì)胞的增殖。故本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人CRC細(xì)胞，以細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率作為研究指標(biāo)，探討GB對(duì)人CRC細(xì)胞的促凋亡作用。結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的GB處理人HCT116細(xì)胞72h后，GB能夠顯著抑制人CRC細(xì)胞增殖，隨著GB濃度的升高，多核、核碎裂細(xì)胞和凋亡小體出現(xiàn)增多，同時(shí)人CRC細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴(lài)性，表明GB能夠促進(jìn)人CRC細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步從分子水平揭示GB促進(jìn)人CRC細(xì)胞凋亡的可能調(diào)節(jié)機(jī)制，分別對(duì)HCT116細(xì)胞內(nèi)Bcl－2蛋白、Bax蛋白和Mfn1蛋白進(jìn)行了研究。

圖5 GB對(duì)人CRC細(xì)胞Bcl－2、Bax和Mfn1蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡是一個(gè)受細(xì)胞內(nèi)酶類(lèi)、內(nèi)源性基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的瀑布式激活過(guò)程，細(xì)胞凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡是多種生物維持其內(nèi)環(huán)境功能平衡和穩(wěn)定的生物學(xué)過(guò)程［16］。Bcl－2家族包含兩類(lèi)功能相互對(duì)立的蛋白，即具有拮抗細(xì)胞凋亡作用的Bcl－2蛋白和能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax蛋白［17］。Bcl－2家族等腫瘤基因均可參與對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。研究［18］顯示，Bcl－2蛋白屬于凋亡抑制蛋白，能夠通過(guò)阻止線(xiàn)粒體膜等部位細(xì)胞色素C的釋放，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。在各種凋亡刺激信號(hào)如生長(zhǎng)因子缺乏、病毒感染和DNA損傷等作用下，髓樣分化因 子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、白介素受體相關(guān)激酶（interleukin receptor－associated kinase，IRAK）和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fas associated death domain，F(xiàn)ADD）等介導(dǎo)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，進(jìn)而抑制下游調(diào)節(jié)蛋白Bcl－2的表達(dá)和激活促凋亡蛋白Bax活性，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體［19］。Rana等［20］發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl－2的低表達(dá)和促凋亡蛋白Bax的高表達(dá)能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不加GB處理的HCT116細(xì)胞Bcl－2蛋白水平較高，Bax蛋白水平較低，與上述結(jié)論相符。Bcl－2和Bax可組成一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控體系，隨著B(niǎo)cl－2表達(dá)量的降低，漸多的Bax蛋白形成穩(wěn)定的Bax/Bax同源二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。不同質(zhì)量濃度GB處理HCT116細(xì)胞后，穩(wěn)定的Bax/Bax二聚體增多，從而提示，GB可能通過(guò)調(diào)節(jié)人CRC細(xì)胞內(nèi)Bcl－2和Bax的相對(duì)表達(dá)水平，不斷增加Bax/Bax同源二聚體形成量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在凋亡過(guò)程中，過(guò)表達(dá)的Bax能夠與Mfn1相互作用，繼而使線(xiàn)粒體發(fā)生片段化，不斷損傷線(xiàn)粒體，阻斷損傷線(xiàn)粒體的融合，誘導(dǎo)凋亡因子產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［22］。線(xiàn)粒體融合作為一種細(xì)胞外膜損傷的維護(hù)機(jī)制，可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡［23］。因此，以 Mfn1蛋白作為研究目標(biāo)，探討GB是否能夠通過(guò)抑制Mfn1蛋白的表達(dá)水平，阻斷損傷線(xiàn)粒體的融合，促進(jìn)人CRC細(xì)胞的凋亡。Western blot結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的GB處理人HCT116細(xì)胞72h后，GB能夠顯著降低CRC細(xì)胞內(nèi)Mfn1蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，GB可能通過(guò)降低人CRC細(xì)胞內(nèi)Mfn1蛋白的表達(dá)，阻斷線(xiàn)粒體融合，并降低人CRC細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)和增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，關(guān)于GB對(duì)人CRC的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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