不同劑量川芎嗪和葛根素配伍對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

陳 玲，韓江全，李文錦

1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 實(shí)驗(yàn)中心（珠海 519000）；2.澳門鏡湖醫(yī)院（澳門 515031）；3.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科（珠海 519100）

腦卒中是導(dǎo)致人類死亡及殘障的主要原因［1－2］，其中缺血性腦卒中大約占所有腦卒中的80%［3］，但目前仍然缺乏有效的治療手段［4］。缺血半暗帶區(qū)凋亡神經(jīng)元的多寡直接決定梗死面積，影響神經(jīng)功能缺失的嚴(yán)重程度；Caspase－3、Cyt－c、NK－κβ與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)。中醫(yī)藥作為我國醫(yī)學(xué)的瑰寶，在治療心腦血管疾病方面歷史悠久，備受關(guān)注。目前，有不少關(guān)于川芎嗪及葛根素單藥成分對(duì)缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究［5－9］，但尚無川芎嗪和葛根素配伍對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)元凋亡及相關(guān)凋亡因子的研究報(bào)道，因而需更深入的研究來為臨床治療提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同劑量的川芎嗪和葛根素組合對(duì)腦缺血細(xì)胞凋亡的影響，探討川芎嗪和葛根素配伍對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)機(jī)制，深入研究其防止腦缺血損傷的協(xié)同作用及量效關(guān)系，以期為研究中藥配伍應(yīng)用于臨床提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠84只，體質(zhì)量320～350g，由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 鹽酸川芎嗪注射液（合肥平光制藥有限公司，批號(hào)：H20050593）；葛根素注射液（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào)：H20033408）。

1.1.3 試劑 蘇木素（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C0105）；伊紅（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C0107）；Tunnel凋亡染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C1091）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（天津厚普生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：A0208）；Caspase－3（Abcam 公司，批號(hào)：Ab32351）；Cyt－c（Abcam 公司，批號(hào)：Ab133504）；NK－κβ（Epitmics公司，批號(hào)：1559－1）。

1.1.4 儀器 手術(shù)器械（上海青浦瀘西儀器廠，XW－80A）；超凈工作臺(tái)（FLUKO 公司，F(xiàn)6－10）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司，IX71）；低溫冷凍離心機(jī)（Sigma公司，3K15）；手握式電動(dòng)勻漿機(jī)（FLUKO公司，F(xiàn)6－10）；漩渦振蕩器（上海青浦瀘西儀器廠，XW－80A）；低速離心機(jī)（上海盧湘儀器廠，TDZ4B－WS）；水浴鍋（萊卡公司，HI1210）；移液器（Thermo 公 司 ）；電 泳 儀（Bio－Rad 公 司，Mini－PROTEAN 3cell）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 左大腦中動(dòng)脈阻塞模型造模方法：大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35mL/100g），仰臥位固定。作頸部正中切口，分離并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈搭一根尼龍線系活扣，頸外動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端分別用一根尼龍線結(jié)扎，兩根結(jié)扎尼龍線間距0.5cm。左側(cè)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾夾閉后，剪短頸外動(dòng)脈上兩根結(jié)扎的尼龍線，然后下翻頸外動(dòng)脈近心端，與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線。從頸外動(dòng)脈剪一個(gè)小口，插入線栓，插入長(zhǎng)度為（20.0±0.5）mm，感到有輕微阻力時(shí)停止。在頸內(nèi)動(dòng)脈處扎緊尼龍線、固定線栓，并扎緊頸總動(dòng)脈近心端尼龍線，取下動(dòng)脈夾，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)護(hù)理。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒后，行Bederson神經(jīng)功能評(píng)分，神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1）無神經(jīng)功能損傷癥狀，動(dòng)物正?；顒?dòng)、進(jìn)食，評(píng)0分；2）將動(dòng)物尾巴提起后，左前肢屈曲，評(píng)1分；3）將動(dòng)物放置平板上，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，評(píng)2分；4）將動(dòng)物放置平板上，用手輕推，向左側(cè)傾倒，評(píng)3分；5）動(dòng)物左側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走，意識(shí)朦朧或喪失，評(píng)4分。評(píng)分≥2分表明模型成功，＜2分予以去除。

1.2.2 分組及給藥 造模成功后的大鼠分為7組，每組12只。給藥劑量參考文獻(xiàn)［8－9］，各組具體給藥方式及劑量如下：1）假手術(shù)組：腹腔注射3mL生理鹽水2次，間隔6h；2）模型組：缺血后0、6h予3mL生理鹽水腹腔注射；3）川芎嗪組：缺血后0、6h予川芎嗪50mg/kg腹腔注射；4）葛根素組：缺血后0、6h予葛根素50mg/kg腹腔注射；5）低劑量組：缺血后0、6h予川芎嗪20mg/kg＋葛根素20mg/kg腹腔注射；6）中劑量組：缺血后0、6h予川芎嗪50mg/kg＋葛根素50mg/kg腹腔注射；7）高劑量組：缺血后0、6h予川芎嗪80mg/kg＋葛根素80mg/kg腹腔注射。

1.2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血后24h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后處死，生理鹽水灌注后取腦。腦組織標(biāo)本1/2用多聚甲醛固定，蠟塊包埋，用于腦組織病理切片。另1/2腦組織置于凍存管中，液氮凍存，用于Western blot檢測(cè)。

1.2.4 觀察指標(biāo)及方法 1）神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分：采用Bederson神經(jīng)功能檢查法；2）腦組織病理學(xué)改變：采用 HE染色檢測(cè)；3）凋亡細(xì)胞檢測(cè)：采用Tunnel法檢測(cè)。4）Caspase－3、Cyt－C和 NF－κβ蛋白表達(dá)：采用Western blot法檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，并采用方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)神經(jīng)功能的影響

與假手術(shù)組比，其他各組大鼠的Bederson神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，低、中、高劑量組大鼠的Bederson神經(jīng)功能評(píng)分降低，且隨劑量增大評(píng)分逐漸下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（n＝12，±s）

表1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（n＝12，±s）

注：與假手術(shù)組相比，＊P＜0.01；與低劑量組比較，＃P＜0.05；與中劑量組比較，＆P＜0.05

組別 神經(jīng)功能缺失評(píng)分/分 凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)/（個(gè)/視野）假手術(shù)組0.17±0.41 0.91±0.65模型組 2.67±0.52＊ 17.98±1.01＊川芎嗪組 2.33±0.52＊ 16.32±1.52＊葛根素組 2.17±0.41＊ 15.98±2.30＊低劑量組 2.17±0.41＊ 15.72±1.85＊中劑量組 1.83±0.41＊ 13.22±1.35＊＃高劑量組 1.67±0.52＊ 11.12±1.12＊＆

2.2 對(duì)局灶腦缺血形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)正常，表現(xiàn)為染色均勻，組織結(jié)構(gòu)清晰致密，神經(jīng)元呈顆粒狀、錐體狀及不規(guī)則形狀，細(xì)胞質(zhì)淡紅色，飽和藍(lán)染，輪廓清楚。模型組大鼠可見灶狀缺血區(qū)，結(jié)構(gòu)紊亂，有水腫，可見神經(jīng)元數(shù)量減少和變性壞死改變。給藥各組腦組織也可見模型組改變，但組織結(jié)構(gòu)紊亂和間質(zhì)水腫較輕，壞死細(xì)胞減少，川芎嗪和葛根素配伍組組織壞死程度改善較單用川芎嗪和葛根素組明顯，且隨著用藥劑量增加病變程度減輕（圖1）。

圖1 不同劑量川芎嗪和葛根素配伍對(duì)大鼠缺血腦組織形態(tài)學(xué)影響（HE染色，×200）

2.3 對(duì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

Tunnel染色顯示，假手術(shù)組僅見極少量棕色凋亡陽性神經(jīng)元；模型組和低、中、高劑量配伍組均有較明顯凋亡陽性神經(jīng)元，細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為胞體縮小、核固縮、染色質(zhì)凝聚，呈棕黃色或黃褐色顆粒狀，呈現(xiàn)出凋亡特征。用藥后，凋亡陽性細(xì)胞減少，黃褐色變淡，配伍用藥較單藥療效明顯，且凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)隨配伍藥物劑量增加而減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1和圖2）。

2.4 對(duì)Caspase－3、Cyt－C、NF－κβ表達(dá)的影響

模型組 Caspase－3、Cyt－C、NF－κβ蛋白較假手術(shù)組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；配伍用藥組較模型組均下降，且在高劑量組較中劑量組下降，中劑量組較低劑量組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2和圖3）。

圖2 不同劑量川芎嗪和葛根素配伍對(duì)大鼠缺血腦組織凋亡細(xì)胞檢測(cè)（Tunnel染色，×400）

表2 各組大鼠Caspase－3、Cyt－C、NF－κβ蛋白表達(dá)水平的濃度（n＝12，±s，μg/μL）

表2 各組大鼠Caspase－3、Cyt－C、NF－κβ蛋白表達(dá)水平的濃度（n＝12，±s，μg/μL）

注：與假手術(shù)組相比，＊P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與低劑量組比較，＠P＜0.05；與中劑量組比較，＆P＜0.05

組別 Caspase－3 Cyt－C NF－κβ假手術(shù)組 4 135.00±143.85 1 415.82±81.53 38 066.33±4 335.53模型組 13 817.12±265.19＊ 35 758.67±62.78＊ 84 345.65±8 431.81＊川芎嗪組 6 798.67±157.00 8 516.33±322.24 77 671.32±5 649.86葛根素組 6 652.67±113.52 32 781.25±570.79 60 224.08±3 347.09低劑量組 7 368.81±332.80＃ 18 789.55±533.42＃ 73 240.21±5 143.65＃中劑量組 6 233.72±615.50＃＠ 12 931.19±122.17＃＠ 51 332.79±4 414.45＃＠高劑量組 5 595.02±361.56＃＠＆ 6 964.06±97.52＃＠＆ 42 274.33±1 348.15＃＠＆

圖3 不同劑量川芎嗪和葛根素配伍對(duì)大鼠缺血腦組織影響

3 討論

腦缺血損傷機(jī)制極為復(fù)雜，炎癥、氧化應(yīng)激以及凋亡各種損傷因素均與缺血損傷及損傷擴(kuò)大的過程密切相關(guān)。由于細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在梗死區(qū)周圍的缺血半暗帶區(qū)，凋亡神經(jīng)元的多寡直接決定著神經(jīng)元壞死數(shù)量和梗死區(qū)域的面積，因此細(xì)胞凋亡在腦缺血損傷中起著重要作用，及時(shí)有效的抗凋亡措施有望成為缺血性腦卒中的有效治療方法［10］。其中，Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)和執(zhí)行過程中起關(guān)鍵作用的一類蛋白水解酶，而Caspase－3是關(guān)鍵的執(zhí)行分子［11］。細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿是凋亡程序關(guān)鍵的一步，在凋亡機(jī)制中發(fā)揮著重大作用［12］。NF－κB作為細(xì)胞內(nèi)最重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，主要通過調(diào)控下游基因如細(xì)胞因子、Bcl－2家族、TRAF和IAP等的表達(dá)參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究川芎嗪和葛根素配伍對(duì)上述凋亡相關(guān)因子的作用，能進(jìn)一步揭示其腦保護(hù)作用的分子機(jī)制，可為川芎嗪和葛根素的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

祖國醫(yī)學(xué)［13］認(rèn)為，“血瘀阻滯腦絡(luò)”是腦損傷的重要發(fā)病機(jī)制，其病機(jī)為氣虛不能統(tǒng)血或氣滯血瘀脈絡(luò)不通。在治療腦缺血損傷中，飲片配伍是臨床應(yīng)用的主要形式，但存在成分不清、機(jī)制不明以及療效不穩(wěn)定等不足；但單用中藥有效組分配伍進(jìn)行研究，又脫離了中醫(yī)理論的指導(dǎo)。中藥有效成分配伍的藥效物質(zhì)基本明確，作用機(jī)制相對(duì)清楚，存在著多種相互影響的反饋機(jī)制，既貫徹了中醫(yī)的病癥結(jié)合、方證對(duì)應(yīng)理念，又克服了傳統(tǒng)飲片配伍化學(xué)成分復(fù)雜及有毒成分不清等缺點(diǎn)，而且劑量準(zhǔn)確、質(zhì)量可控、針對(duì)性強(qiáng)，是當(dāng)今中醫(yī)藥現(xiàn)代化中的中藥配伍新模式［14］。川芎和葛根合用遵循了中藥的配伍理論和方法，有通陽活血之效，并且針對(duì)了腦缺血損傷的病機(jī)。川芎嗪為中藥川芎的有效成分之一，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究［15］證實(shí)，它可擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、有效清除自由基，并可作為鈣拮抗劑起作用。而葛根素為中藥野葛根中提取的一種黃酮苷，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗氧化劑、修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷等作用［16］。臨床上，川芎嗪與葛根素合用治療缺血性腦血管病具有協(xié)同作用。新近研究［17－18］表明，川芎嗪合用葛根素，可相互提高血藥濃度，延長(zhǎng)其體內(nèi)作用時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同劑量的川芎嗪和葛根素組合對(duì)腦缺血細(xì)胞凋亡的影響，探討川芎嗪和葛根素配伍對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)機(jī)制，深入研究其防止腦缺血損傷的協(xié)同作用及量效關(guān)系，可為研究中藥配伍應(yīng)用于臨床提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與其他5個(gè)用藥組在神經(jīng)功能缺失評(píng)分上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但神經(jīng)功能評(píng)分較模型組降低，而增加配伍藥物劑量后，神經(jīng)功能有所改善。在組織病理學(xué)改變及凋亡細(xì)胞表達(dá)上，模型組組織水腫、凋亡形態(tài)更明顯，凋亡細(xì)胞表達(dá)計(jì)數(shù)明顯增多；配伍用藥治療后，病理組織水腫及凋亡改變有改善，凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，增加配伍用藥劑量可使上述狀況進(jìn)一步改善。模型組 Caspase－3、Cyt－C和 NF－κβ蛋白較假手術(shù)組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明上述3個(gè)凋亡因子在細(xì)胞凋亡途徑中起重要作用。配伍用藥與模型組相比較，上述3個(gè)凋亡因子均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明配伍用藥可有效改善缺血損傷細(xì)胞凋亡，其潛在機(jī)制可能為下調(diào)Caspase－3、Cyt－C和 NF－κβ蛋白表達(dá)；且高劑量組上述3個(gè)凋亡因子較中劑量組下降，中劑量組較低劑量組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明在一定范圍內(nèi)增加藥物劑量可以下調(diào)凋亡因子，改善大鼠腦缺血損傷。

綜上所述，川芎嗪和葛根素配伍可以協(xié)同治療缺血性大鼠腦卒中，降低腦損傷程度，且在一定范圍內(nèi)與劑量成正相關(guān)。

［1］Lo EH.Degeneration and repair in central nervous system disease［J］.Nat Med，2010，16（11）：1205－1209.

［2］Moskowitz MA，Lo EH，Iadecola C.The science of stroke：Mechanisms in search of treatments［J］.Neuron，2010，67（2）：181－198.

［3］孫世光.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010［J］.中華神經(jīng)科雜志，2010，43（2）：146－153.

［4］Fan W，Dai Y，Xu H，et al.Caspase－3modulates regenerative response after stroke［J］.Stem Cells，2014，32（2）：473－486.

［5］韓江全，于奎營(yíng)，何敏，等.葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注側(cè)皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡及p－Akt（Ser473）表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（8）：1069－1072.

［6］韓江全，李均，李官成，等.葛根素對(duì)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（19）：1912－1913.

［7］韓江全，李官成，周曉蘭，等.葛根素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（10）：1179－1181.

［8］韓江全，李均，李官成，等.葛根素對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響［J］.西部醫(yī)學(xué)，2009，21（11）：1844－1846.

［9］王玉，萬海同，嚴(yán)偉民，等.川芎嗪與葛根素合用對(duì)海馬神經(jīng)元損傷后的影響［J］.中國中藥雜志，2008，33（4）：424－427.

［10］Wu J，Li J，Hu H，et al.Rho－kinase inhibitor，fasudil，prevents neuronal apoptosis via the Akt activation and PTEN inactivation in the ischemic penumbra of rat brain［J］.Cellular and Molecular Neurobiology，2012，32（7）：1187－1197.

［11］Brentnall M，Rodriguez ML，De Guevara RL，et al.Caspase－9，caspase－3and caspase－7have distinct roles during intrinsic apoptosis［J］.BMC Cell Biology，2013，14（1）：32.

［12］Caroppi P，Sinibaldi F，F(xiàn)iorucci L，et al.Apoptosis and human diseases：mitochondrion damage and lethal role of released cytochrome C as proapoptotic protein［J］.Current Medicinal Chemistry，2009，16（31）：4058－4065.

［13］王永炎.中醫(yī)內(nèi)科學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994：124－125.

［14］陳暢，李馬興，滿國峰，等.組合藥物－現(xiàn)代藥物研發(fā)的新趨勢(shì)［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑雜志，2012，18（14）：310－312.

［15］萬海同，王玉，楊潔紅，等.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元糖氧剝奪損傷模型的建立及川芎嗪對(duì)其胞內(nèi)鈣離子的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（3）：234－236.

［16］徐曉虹，陳瑜，鄭筱祥.葛根素對(duì)腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（21）：1628－1631.

［17］韓鳳梅，潘瑩，杜鵬，等.丹參、川芎與葛根配伍對(duì)葛根素的大鼠藥動(dòng)學(xué)影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44（19）：1497－1499.

［18］王玉，萬海同，嚴(yán)偉民，等.川芎嗪與葛根素合用對(duì)海馬神經(jīng)元損傷后的影響［J］.中國中藥雜志，2008，33（4）：424－427.