油菜黃籽形成的分子機(jī)制研究

劉忠松，官春云，嚴(yán)明理，劉顯軍，陸 贏

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長(zhǎng)沙410128）

油菜黃籽形成的分子機(jī)制研究

劉忠松，官春云，嚴(yán)明理，劉顯軍，陸 贏

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長(zhǎng)沙410128）

利用自然突變的遺傳穩(wěn)定黃籽材料，并且培育遺傳背景相同的近等基因系，將種子的種皮和胚分離，從種皮顏色的決定物質(zhì)研究入手，運(yùn)用組織化學(xué)、遺傳學(xué)、群體基因組學(xué)的方法，對(duì)油菜黃籽形成的分子機(jī)制和起源馴化進(jìn)行了深入、系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)原花色素在油菜種皮中積累決定種皮顏色，油菜黃籽源于調(diào)控原花色素合成的轉(zhuǎn)錄因子基因TT8突變，致使DFR等基因不能被激活轉(zhuǎn)錄，從而不能催化原花色素生物合成底物的形成，原花色素合成需要的乙酰輔酶A被用于油的合成，減少種皮厚度，提高種子含油量。芥菜型油菜黃籽是在芥菜型油菜成種后在中國(guó)人工選擇馴化的產(chǎn)物。創(chuàng)建了基于苗期黃籽基因型選擇+種子發(fā)育早期香草醛染色觀察的甘藍(lán)型油菜黃籽高油分芥甘種間雜交育種體系，并成功用于育種實(shí)踐。

油菜；黃籽；種皮顏色；基因克??；馴化；育種

油菜種子是由胚珠受精后發(fā)育而成，包括胚、胚乳和種皮三部分，其中胚由母本的卵細(xì)胞與父本的精細(xì)胞結(jié)合所形成的合子發(fā)育而成，而種皮只由母體組織珠被發(fā)育而成，因而具有與母體植株相同的基因型。發(fā)育中的油菜種子由于含有葉綠素，種子外觀呈綠色；隨著種子成熟，種皮顏色改變，成熟的油菜種子有黑色、紅褐色和黃色等類(lèi)型（圖1A，封三）。黑色、紅褐色種子（黑籽、褐籽）的種皮中積累大量色素，而黃色種子（黃籽）的種皮不積累色素，是透明的，因而黃籽呈現(xiàn)的顏色是胚的顏色（圖1B，封三）。

油菜黃籽比黑籽休眠短、易萌發(fā)、含油量高，已被國(guó)內(nèi)外許多研究者所證實(shí)。筆者2010年將100份芥菜型油菜種質(zhì)資源種植于蘭州和昆明，考察其種皮顏色，并測(cè)定其種子含油量，發(fā)現(xiàn)52份黃籽材料平均含油量為36.41%，變幅為28.62%～43.96%，48份黑褐籽材料平均含油量為32.55%，變幅為24.46%～39.81%，兩者差異極顯著，平均含油量相差近4個(gè)百分點(diǎn)（未發(fā)表）。因此，國(guó)內(nèi)外都把培育黃籽油菜品種作為油菜高油分育種的一條重要途徑。

盡管油菜黃籽是提高含油量的重要途徑，通過(guò)甘白、芥甘雜交等育種方法也選育出了一些黃籽油菜品種應(yīng)用于生產(chǎn)，但直到21世紀(jì)初，對(duì)于油菜黃籽形成的認(rèn)識(shí)還停留在性狀遺傳上。受擬南芥透明種皮（Transparent Testa，TT）研究的啟發(fā)，利用天然突變、穩(wěn)定遺傳的芥菜型油菜黃籽種質(zhì)作為材料，筆者開(kāi)始油菜黃籽形成的分子機(jī)制探索。在國(guó)家自然科學(xué)基金、教育部科技項(xiàng)目的連續(xù)資助下，經(jīng)過(guò)15年的研究，目前已經(jīng)闡明了油菜決定種皮顏色的物質(zhì)，圖位克隆了芥菜型油菜控制種皮顏色的基因，揭示了種皮顏色基因調(diào)控黃籽形成過(guò)程，分析了種皮顏色基因的等位變異和黃籽的起源，創(chuàng)建了基于苗期黃籽基因型選擇+種子發(fā)育早期香草醛染色觀察的甘藍(lán)型油菜黃籽高油分芥甘種間雜交育種體系，并成功用于育種實(shí)踐。

1　油菜決定種皮顏色的色素物質(zhì)

油菜在授粉后30～40 d內(nèi)，黃籽和黑籽品種的種皮顏色無(wú)明顯差別，均為綠色。但種皮的化學(xué)組成不一樣，在授粉后10～15 d，決定種皮顏色形成的物質(zhì)已經(jīng)開(kāi)始合成。

前人采用光譜技術(shù)進(jìn)行了定量比較分析，認(rèn)為油菜種皮中含有花色素、類(lèi)黃酮、木質(zhì)素、黑色素以及酚類(lèi)等發(fā)色和助色物質(zhì)［1，2］。但由于技術(shù)本身的限制，這些研究并未能確定是上述哪種或哪些物質(zhì)決定了種皮顏色。

油菜種子中酚類(lèi)物質(zhì)含量高，通過(guò)光譜分析，發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜黃、黑籽種皮的多酚含量接近（黃籽種皮的多酚含量約為黑籽種皮的90%［3，4］），顯著區(qū)別于甘藍(lán)型油菜的10%［5］。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了香草醛試驗(yàn)和物質(zhì)特征吸收峰分析等定性研究。香草醛染色試驗(yàn)表明，黑籽種皮與香草醛反應(yīng)呈紅色，而黃籽種皮沒(méi)有該特征色。紅色是黃烷醇類(lèi)的3，4位酚羥基與香草醛發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)所致，推測(cè)黑籽種皮多酚應(yīng)含在C環(huán)上有3-OH結(jié)構(gòu)的兒茶素類(lèi)黃烷醇分子。加入NaOH、AlCl3、NaAC+H3BO3等位移試劑后特征吸收峰分析表明，黃籽種皮中的黃酮醇類(lèi)分子骨架A環(huán)上可能主要是單酚羥基，而黑籽種皮黃酮醇類(lèi)分子骨架A環(huán)上可能主要是鄰二酚羥基，具有鄰二酚羥基黃酮醇可縮合成原花色素，這可能是黑籽種皮中的原花色素含量顯著高于黃籽種皮的主要原因［3］。進(jìn)一步將四川黃籽及其褐籽近等基因系NILA和NILB以及供體親本紫葉芥的種皮和胚分開(kāi)后，用香草醛和DMACA（專(zhuān)一與黃烷-3，4-二羥基醇和黃烷-4-羥基醇結(jié)合的試劑）染色，發(fā)現(xiàn)不論黃籽還是黑籽，胚都能被香草醛和DMACA分別染成紅色和藍(lán)色，但種皮不同，黃籽種皮用香草醛和DMACA都不能染色，說(shuō)明黃籽種皮不含有黃烷3，4-二羥基醇和黃烷4-羥基醇，不能合成積累原花色素（圖1B，封三）［6］。

用香草醛和鹽酸-正丁醇染色法觀察了四川黃籽、NILA、NILB和紫葉芥種子不同發(fā)育時(shí)期的種皮中原花色素積累動(dòng)態(tài)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)原花色素是芥菜型油菜種皮顏色的決定物質(zhì)，觀察芥菜型油菜黃、黑褐籽材料各19份和甘藍(lán)型油菜黃、黑籽各6份，結(jié)果顯示原花色素是這些油菜種皮顏色的決定物質(zhì)［7］。

原花色素是決定油菜種皮顏色的主要物質(zhì)，為后來(lái)的質(zhì)譜分析所證實(shí)［8～10］，原花色素僅存在種皮［11］。

2　油菜種皮顏色的調(diào)控基因克隆

前人多數(shù)研究認(rèn)為芥菜型油菜黃籽性狀是由2對(duì)隱性重疊基因控制，個(gè)別研究認(rèn)為是由2個(gè)顯性上位互作基因控制或單個(gè)隱性基因控制［12，13］。2個(gè)基因位點(diǎn)處于不同連鎖群上，并找到了連鎖的分子標(biāo) 記［14～17］。

在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了四川黃籽與紫葉芥高代回交單基因分離群體，建立分子標(biāo)記與種皮顏色基因連鎖分析的分析模型，進(jìn)行基因定位和比較作圖分析，結(jié)果將芥菜型油菜種皮顏色基因位點(diǎn)所在的2個(gè)連鎖群分別對(duì)應(yīng)于A09和B03染色體，并將A09染色體黃籽基因鎖定在0.9 cM區(qū)間內(nèi)［18～20］。

由于A基因組的基因信息資源較多，筆者利用已公布的白菜基因組序列、韓國(guó)白菜BAC序列開(kāi)發(fā)標(biāo)記和蕓薹屬植物A09連鎖群已定位標(biāo)記共316個(gè)標(biāo)記進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中31個(gè)標(biāo)記與芥菜型油菜A09染色體控制種皮顏色的基因連鎖，S88-Ⅳ-2、H032N11-2和S121-Ⅰ-2為共分離標(biāo)記。利用共分離標(biāo)記篩選構(gòu)建的作圖群體親本紫葉芥的BAC文庫(kù)（ZBjuH BAC文庫(kù)），陽(yáng)性BAC末端測(cè)序，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了46對(duì)引物，分析發(fā)現(xiàn)12個(gè)連鎖標(biāo)記。利用這些標(biāo)記對(duì)由5 434株植株組成的BC8F2群體進(jìn)行精細(xì)定位，結(jié)果表明芥菜型油菜BAC末端序列標(biāo)記68N6和132O01R也與黃籽基因共分離，側(cè)翼標(biāo)記S134-16和S102-5相距都為0.04 cM。利用共分離標(biāo)記和側(cè)翼標(biāo)記篩選ZBjuH BAC文庫(kù)，構(gòu)建了由11個(gè)BACs組成的A09染色體黃籽基因區(qū)域BAC重疊群［21］。將這些BACs進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序、序列組裝和功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)這個(gè)長(zhǎng)約1.05 Mb的BAC重疊群編碼66個(gè)基因，其中Gene_24為擬南芥基因At4g09820（TT8）的同源基因。該基因是在類(lèi)黃酮生物合成途徑中起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子基因，因此推測(cè)該基因?yàn)辄S籽候選基因。利用該候選基因的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)BjuT8U4，擴(kuò)增作圖群體的黑籽親本紫葉芥和黃籽親本四川黃籽的目的基因，結(jié)果各有2個(gè)拷貝，分別命名為BjuA.TT8和BjuB.TT8，其中BjuA.TT8基因核苷酸序列在黃、黑籽親本間不僅有SNP位點(diǎn)多態(tài)性，而且在黃籽親本中BjuA.TT8外顯子7有一段長(zhǎng)為1 275 bp的序列插入，而B(niǎo)juB.TT8基因的序列在黃、黑籽親本間僅在外顯子7有一個(gè)C-T轉(zhuǎn)換［22］。

由于B基因組的基因信息資源較少，為了能開(kāi)發(fā)定位標(biāo)記，筆者對(duì)四川黃籽及其近等基因系種皮RNA測(cè)序（RNA-seq）組裝的unigenes進(jìn)行了分析。理論上由于四川黃籽與其B03染色體BC8F5代褐籽近等基因系NILB只有與控制種皮顏色的基因緊密連鎖的基因存在序列差異，其他基因都與四川黃籽相同。分析結(jié)果表明，465個(gè)unigenes存在序列差別。利用有刪除插入（InDel）的unigenes開(kāi)發(fā)引物10個(gè)，篩選ZBjuH BAC文庫(kù)，獲得由2個(gè)BACs組成的重疊群。將BACs進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序、序列組裝和功能注釋后，發(fā)現(xiàn)這個(gè)長(zhǎng)約0.25 Mb的BAC重疊群編碼12個(gè)基因，其中一個(gè)又是At4g09820的同源基因（未發(fā)表結(jié)果），其序列與由BjuT8U4引物對(duì)從紫葉芥中擴(kuò)增獲得的BjuB.TT8基因序列一致。

上述研究結(jié)果與之前（2009）關(guān)于油菜種皮顏色調(diào)控基因的本質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子基因［20］的推測(cè)一致。2011年筆者在第13屆國(guó)際油菜大會(huì)上初步報(bào)道了這些研究結(jié)果［23］。2013年印度Padmaja等人［24］報(bào)道了同樣結(jié)果，不過(guò)他們的黃籽BjuA.TT8基因的插入片段為1 279 bp，經(jīng)核實(shí)是他們的序列存在測(cè)序錯(cuò)誤。

3　油菜黃籽形成的分子機(jī)制

油菜黃籽的種皮不合成積累原花色素，黃籽親本的調(diào)控原花色素合成的轉(zhuǎn)錄因子基因Bju.TT8發(fā)生了突變，突變的Bju.TT8基因怎么導(dǎo)致了種皮中原花色素的合成積累受阻？筆者于2008年首先采用同源克隆方法從芥菜型油菜中克隆了原花色素生物合成途徑的4-二氫黃酮醇還原酶（DFR）基因，通過(guò)RT-PCR研究其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DFR基因在芥菜型油菜紫葉芥和黑籽近等基因系的葉片、胚和種皮中都表達(dá)，在四川黃籽中只在葉片和胚中表達(dá)，但在種皮中不表達(dá)，并提出DFR基因在黃籽種皮中不表達(dá)導(dǎo)致種皮中原花色素不能合成，從而種皮透明，形成黃籽［25］。采用同樣的方法，證明花色素合成酶（ANS）基因也具有相同的表達(dá)模式，在黃籽種皮中不表達(dá)［6］。這些結(jié)果后來(lái)被芯片分析和RNA -seq進(jìn)一步證實(shí)。四川黃籽及其褐籽近等基因系NILA、NILB授粉后15 d種皮RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)分別有1 304個(gè)和1 273個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括類(lèi)黃酮合成途徑基因（圖2）［26］。

在四川黃籽種皮中發(fā)現(xiàn)的DFR、ANS基因不表達(dá)現(xiàn)象，是否也在其他黃籽材料中存在呢？分析Varuna（印度品種）、藏油1號(hào)等另外3個(gè)黑籽品種和努西納（俄羅斯品種）、會(huì)理高足黃油菜（四川地方品種）等另外6個(gè)黃籽材料種皮中DFR、ANS等基因的表達(dá)，證實(shí)了在所有黃籽材料的種皮中原花色素合成途徑基因都不表達(dá)。Akhov等在甘藍(lán)型油菜中也證實(shí)黃籽是DFR酶活性降低所致［8］。

黃籽種皮中原花色素合成途徑基因不表達(dá)，是這些基因本身突變的結(jié)果還是受其他基因調(diào)控的結(jié)果？為了回答這一問(wèn)題，筆者克隆了紫葉芥、四川黃籽中的19個(gè)原花色素合成途徑已知基因的61個(gè)拷貝并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在黃、黑籽材料之間DFR、ANS、 BAN等基因在外顯子序列和啟動(dòng)子序列上沒(méi)有差異［25，27～32］，說(shuō)明DFR、ANS、BAN等基因在黃籽種皮中不表達(dá)是受其他基因調(diào)控的結(jié)果。

在油菜近緣植物擬南芥中DFR、ANS、BAN等基因在種皮中的表達(dá)受TT2（MYB轉(zhuǎn)錄因子）、TT8（bHLH轉(zhuǎn)錄因子）、TTG1（WD40蛋白質(zhì)）組成的復(fù)合體MBW的調(diào)控。紫葉芥、四川黃籽及其近等基因系的TTG1、TT2基因在基因序列和表達(dá)量上都沒(méi)有差異。正如前述，TT8基因在基因序列上存在插入和堿基轉(zhuǎn)換，但其表達(dá)量如何呢？筆者進(jìn)行了兩個(gè)試驗(yàn)。一是將RT-PCR產(chǎn)物電泳分析和用限制酶進(jìn)行酶切分析，結(jié)果表明四川黃籽及其近等基因系種皮中Bju.TT8基因都表達(dá)。二是比較RNA-seq中Bju.TT8在黃、黑籽種皮中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，并用qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明表達(dá)量沒(méi)有差別［22，26，27，30］。黃籽材料Bju.TT8基因雖然突變，但在種皮中仍然表達(dá)，這種突變基因的表達(dá)蛋白為什么不能激活原花色素合成途徑DFR、ANS、BAN等基因的表達(dá)？筆者克隆、分析了DFR、ANS、BAN等基因的啟動(dòng)子，采用酵母單雜交試驗(yàn)，檢測(cè)野生型和突變Bju.TT8蛋白與DFR、ANS、BAN基因的啟動(dòng)子的互作情況，結(jié)果表明野生型Bju.TT8蛋白能與DFR、ANS和BAN基因啟動(dòng)子結(jié)合，但突變BjuA.TT8蛋白不能與DFR、ANS和BAN基因啟動(dòng)子結(jié)合，突變BjuB.TT8蛋白不能與DFR基因啟動(dòng)子結(jié)合，說(shuō)明組成MBW復(fù)合體的Bju.TT8基因突變導(dǎo)致不能激活DFR等基因轉(zhuǎn)錄［33］。

由于黃籽種皮中DFR等基因不能轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致原花色素生物合成上游基因查爾酮合成酶（CHS／TT4）和下游谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（TT19）基因表達(dá)下調(diào)［22］，影響種皮中包括原花色素、木質(zhì)素和芥子堿三類(lèi)次生產(chǎn)物在內(nèi)的類(lèi)黃酮代謝。

4　芥菜型油菜黃籽的起源與馴化

芥菜型油菜起源于亞洲，但起源于亞洲何地尚存爭(zhēng)議［34］。筆者從黃籽基因等位性入手，將四川黃籽、273-1（西藏野生材料）、努西納、Cutlass（加拿大品種）等12個(gè)品種分成2組進(jìn)行雙列雜交，觀察雜種F1植株上種子的顏色，結(jié)果所有雜種F1植株均結(jié)黃籽，說(shuō)明這些材料黃籽基因是等位的［20］。對(duì)Varuna、Brown Mustard（加拿大品種）等8份黑籽材料和會(huì)理高足黃油菜、努西納、Cutlass、Domo（加拿大品種）等14份黃籽材料用17個(gè)與種皮顏色基因連鎖標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明所有黃籽材料在種皮顏色基因位點(diǎn)區(qū)域都具有相同的標(biāo)記基因型（單倍型）［20］，而黑籽材料這些區(qū)段發(fā)生了廣泛重組，表明中國(guó)、俄羅斯、加拿大、印度和巴基斯坦的芥菜型油菜黃籽資源在黃籽調(diào)控基因位點(diǎn)附近具有高度相同的基因型，由此提出芥菜型油菜黃籽材料在進(jìn)化過(guò)程中是單一起源。克隆獲得黃籽調(diào)控基因后，筆者從美國(guó)、德國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家種質(zhì)庫(kù)征集包括芥菜型油菜在內(nèi)的芥菜4個(gè)亞種的種質(zhì)約500份，選擇其中來(lái)自全球33個(gè)國(guó)家196份材料自交純化（S2～S6代）后，利用基因特異引物擴(kuò)增Bju.TT8基因，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BjuA.TT8基因除了紫葉芥、四川黃籽所具有的2個(gè)等位基因外，還發(fā)現(xiàn)另外3個(gè)新的等位基因（其中1個(gè)刪除突變，2個(gè)插入突變），而B(niǎo)juB.TT8基因只有紫葉芥、四川黃籽所具有的2個(gè)等位基因，在黑籽材料中BjuA.TT8基因或BjuB.TT8基因可能單個(gè)突變，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)突變的材料［33］。芥菜分為4個(gè)亞種［35］，根用（ssp.napiformis）、莖用（ssp.tsatsai）材料中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變等位基因，葉用（ssp.integrifolia）材料中發(fā)現(xiàn)有BjuA.TT8基因或BjuB.TT8基因突變等位基因材料，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)突變的材料，籽用（ssp.juncea）材料中發(fā)現(xiàn)有 BjuA.TT8基因或BjuB.TT8基因突變等位基因材料，也發(fā)現(xiàn)同時(shí)突變的材料即黃籽材料（圖3）。自然界出現(xiàn)了3種黃籽單倍型（表1），但只有一種單倍型即BjuA.TT8基因1 275 bp插入的黃籽類(lèi)型廣泛分布，在所分析的78份黃籽材料中有73份為這一類(lèi)型，占93%，俄羅斯、加拿大、波蘭、德國(guó)、丹麥、澳大利亞、印度、巴基斯坦等國(guó)家的黃籽材料只有這種類(lèi)型。

圖3　芥菜型油菜黃籽的起源

表1　黃籽等位基因在芥菜亞種的分布

據(jù)文獻(xiàn)記載，中國(guó)芥菜經(jīng)過(guò)尼泊爾傳到印度，在9世紀(jì)前傳到日本，18世紀(jì)末經(jīng)東（黑龍江）、西（新疆）兩條途徑引種到前蘇聯(lián)、東歐國(guó)家，大約1860年輸入英國(guó)，1936年到達(dá)北美，然后由英國(guó)傳播到西歐和澳大利亞，加拿大的芥菜型油菜分別從英國(guó)、前蘇聯(lián)和中國(guó)引種而來(lái)［36～43］。芥菜型黃籽油菜起源于東方，中國(guó)—東歐類(lèi)型芥菜型油菜既有黑籽、褐籽種質(zhì)，也有大量的黃籽種質(zhì)（約占種質(zhì)的50%），但印度—巴基斯坦類(lèi)型芥菜型油菜只有黑籽、褐籽種質(zhì)，沒(méi)有黃籽種質(zhì)［37］，在北美把黑褐籽芥菜型油菜叫做印度芥菜（Indian mustard），而把黃籽芥菜型油菜叫做東方芥菜（Orientalmustard），據(jù)此可推測(cè)芥菜型油菜黃籽起源于中國(guó)。白菜型油菜天然黃籽也是TT8基因突變所致，黃籽的BraA.TT8基因在內(nèi)含子2插入了一段4 320 bp長(zhǎng)的Helitron轉(zhuǎn)座子片段［44］，與芥菜型油菜黃籽Bju.TT8基因的外顯子7突變位置不同，說(shuō)明芥菜型油菜黃籽突變Bju.TT8基因并非來(lái)自其祖先種白菜型油菜，黃籽性狀是芥菜成種后人工選擇馴化的結(jié)果。中國(guó)在公元前6世紀(jì)已有芥菜的記載，周朝時(shí)已利用芥菜籽作調(diào)味品［45］，黃籽類(lèi)型只出現(xiàn)在利用早的籽用材料中，而沒(méi)有出現(xiàn)在利用遲的葉用芥（6世紀(jì)開(kāi)始利用）、根用芥（16世紀(jì)）和莖用芥（18世紀(jì)），說(shuō)明芥菜型黃籽油菜馴化時(shí)間早，與用途有關(guān)。

5　油菜黃籽高含油的機(jī)制

將四川黃籽及其近等基因系夏季種植于昆明，從授粉后15～40 d種子每隔5 d收獲種子，測(cè)定千粒重、含油量以及種皮原花色素、木質(zhì)素含量，結(jié)果表明，盡管黃籽親本與2個(gè)褐籽近等基因系的千粒重沒(méi)有顯著差異，但黃籽親本的油分積累速率從授粉后25 d顯著快于褐籽近等基因系，與此同時(shí)近等基因系種皮中的原花色素和木質(zhì)素加快合成積累，而黃籽親本種皮中的原花色素和木質(zhì)素保持低水平（圖4）［46］。這說(shuō)明種子中油的合成積累與種皮中原花色素和木質(zhì)素合成積累存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，與油脂、原花色素和木質(zhì)素的合成都需要共同的底物乙酰輔酶A是一致的，與四川黃籽種皮?。ǘ嗄隃y(cè)定皮殼率為10%～12%）、褐籽近等基因系種皮厚（多年測(cè)定皮殼率為14% ～16%）也是一致的。

圖4　授粉后黃籽親本（SY）與2個(gè)褐籽近等基因系（NILA、NILB）的千粒重、含油量、種皮原花色素和木質(zhì)素含量變化

6　油菜黃籽高油分育種方法創(chuàng)建

甘藍(lán)型油菜是油菜的主栽類(lèi)型，但沒(méi)有天然的黃籽材料。選育甘藍(lán)型黃籽油菜品種，多通過(guò)與白菜型油菜、芥菜型油菜等近緣種的黃籽材料雜交，將黃籽性狀基因?qū)敫仕{(lán)型油菜中。同白菜型油菜一樣，芥菜型油菜2個(gè)黃籽調(diào)控基因一個(gè)在A09染色體（BjuA09.TT8），另一個(gè)在B03染色體（BjuB03.TT8），異源四倍體的芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜分別具有AABB和AACC染色體組，BjuA09.TT8可通過(guò)同源重組由芥菜型油菜轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜。但BjuB03.TT8如何轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜、轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜基因組哪里，還面臨兩個(gè)問(wèn)題:一是芥甘雜交后代，由于B組染色體不能配對(duì)［47，48］，包括B03染色體在內(nèi)的B組染色體在后代中可能丟失，如何防止BjuB03.TT8丟失？二是甘藍(lán)型油菜也有2個(gè)TT8基因，分別位于A09和C09染色體上即BnaA09.TT8（BnaA09g22810D）和BnaC09.TT8（BnaC09g24870D）［49］，在芥甘雜種后代中它們尤其是BnaC09.TT8能否成功替代或淘汰？再者，黃籽是隱性性狀，且種皮顏色要等種子成熟時(shí)才能考察，能不能在種子發(fā)育早期甚至或苗期就進(jìn)行黃籽性狀選擇？

在克隆油菜黃籽調(diào)控基因、揭示種皮顏色的決定物質(zhì)后，筆者創(chuàng)建了基于苗期黃籽基因型選擇+種子發(fā)育早期香草醛染色觀察的甘藍(lán)型油菜黃籽高油分芥甘種間雜交育種體系。具體做法:（1）芥甘雜交早期世代如BC1F1和BC1F2的育性低，需要用甘藍(lán)型油菜回交，難以獲得大量種子，不能考察種皮顏色，且后代分離大［50，51］，來(lái)自芥菜型黃籽油菜的突變基因和來(lái)自甘藍(lán)型黑籽油菜的TT8都存在于雜種后代中，在苗期采用TT8基因特異標(biāo)記跟蹤BjuA09.TT8和BjuB03.TT8突變基因，選留具有2個(gè)突變基因的后代植株，實(shí)施DNA標(biāo)記輔助前景基因型選擇。（2）對(duì)芥甘雜交中期世代，在前景基因型選擇的基礎(chǔ)上，對(duì)選留植株在開(kāi)花授粉后15 d用0.5%香草醛將種皮染色5 min，選留不染色的植株，淘汰染紅的植株，由于油菜花期長(zhǎng)達(dá)25～35 d，因而可以對(duì)選留植株后面開(kāi)放的花朵進(jìn)行育種處理，使得對(duì)黃籽性狀的表型選擇能提早一代進(jìn)行［7］。（3）對(duì)芥甘雜交已育成的黃籽株系，利用與黃籽基因連鎖分子標(biāo)記和不連鎖分子標(biāo)記分別進(jìn)行重組體選擇和背景基因型選擇［52，53］，加快向甘藍(lán)型油菜回復(fù)的速度，進(jìn)一步縮短育種周期。

應(yīng)用基于苗期黃籽基因型+種子發(fā)育早期香草醛染色觀察的甘藍(lán)型油菜黃籽高油分芥甘種間雜交育種方法，筆者利用芥菜型黃籽品種四川黃籽與甘藍(lán)型黑籽油菜株系1047雜交，雜種F1與加拿大甘藍(lán)型春油菜低亞麻酸品種Stellar雜交，成功選育出甘藍(lán)型純黃籽高油分新品系“黃矮早”［54，55］。這種黃籽新品系黃籽性狀穩(wěn)定，100%植株黃籽，經(jīng)農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心連續(xù)2年檢測(cè)，含油量穩(wěn)定在50%以上，最高達(dá)到52.38%，SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）標(biāo)記分析和基因組重測(cè)序表明存在來(lái)自四川黃籽的染色體片段導(dǎo)入。

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S565.403.2

A

1001-5280（2015）06-0694-07

10.3969／j.issn.1001-5280.2015.06.29

2015-10-10

劉忠松（1963-），男，湖南常寧市人，教授，博士生導(dǎo)師，從事作物遺傳育種研究與教學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（30471098，30971799，31101176，31271762）；教育部科技重點(diǎn)項(xiàng)目（204102）。