巴戟天藥材中耐斯糖含量近紅外光譜測定方法的建立

周文婷，林 萍，王海霞，姬生國

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巴戟天藥材中耐斯糖含量近紅外光譜測定方法的建立

周文婷，林 萍，王海霞，*姬生國

(廣東藥學院中藥學院，廣東，廣州510006)

目的 建立巴戟天藥材中耐斯糖含量的近紅外光譜測定方法。方法 用高效液相色譜法測定114批巴戟天藥材中耐斯糖含量，采集近紅外光譜后，運用多元散射校正法，結(jié)合最小偏二乘法建立巴戟天耐斯糖含量的定量模型。結(jié)果 建立的耐斯糖近紅外光譜定量模型，內(nèi)部交叉驗證決定系數(shù)為0.979 1，校正標準偏差為0.909 0，預測標準差為0.909 0，交叉驗證的標準偏差為1.093 0。結(jié)論 該含量測定近紅外光譜模型穩(wěn)定、準確適用于巴戟天藥材中耐斯糖的含量測定。

巴戟天；耐斯糖；近紅外光譜；定量模型

巴戟天為常用的中藥材，具有補腎助陽、強筋壯骨、祛風除濕等功效[1]。耐斯糖為2010版《中國藥典》所規(guī)定的巴戟天指標性成分，其含量測定采用HPLC法。近紅外光譜分析技術(shù)（NIRS）是在近幾年發(fā)展迅速的一種中藥質(zhì)量分析技術(shù)，具有快速、方便、對樣品無損的分析技術(shù)，光譜信息量豐富，圖譜穩(wěn)定性高等特點[2]，被廣泛應用于中藥材、中成藥的定量、定性鑒別中。本課題組經(jīng)過數(shù)年的研究，以道地的嶺南中藥材為研究對象，以陳皮的本草研究為基礎[3]，成功將該技術(shù)應用于廣陳皮、陳皮[4]以及其他藥材，如廣藿香[5-10]、高良姜[11-12]、枇杷葉[13-14]、廣金錢草[15]、巴戟天[16]等中藥材及部分中藥制劑的質(zhì)量評價中。本研究通過應用該技術(shù)對巴戟天中耐斯糖含量進行測定，以期為藥材加工、生產(chǎn)等企業(yè)及同行分享巴戟天藥材及制劑的質(zhì)量控制方法。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥材

本試驗所需藥材分別從廣西省梧州市古龍鎮(zhèn)、太平鎮(zhèn)、嶺景鎮(zhèn)；廣東省云浮市大方鎮(zhèn)、千官鎮(zhèn)；肇慶市高良鎮(zhèn)等地的種植和栽培基地進行采集。采收期為2013年6~7月。經(jīng)廣東藥學院中藥學院姬生國教授鑒定為茜草科巴戟天屬植物巴戟天How.的根。藥材先置于烘箱中烘至七成干，取出，錘扁后烘至全干，粉碎過50目篩，備用。

1.1.2 儀器與試劑

傅立葉變換近紅外光譜儀，配有樣品旋轉(zhuǎn)器和石英樣品杯、漫反射積分球、OPUS光譜采集軟件(Tensor37型，德國Bruker公司) 和TQ8.0分析軟件。1120型全自動高效液相色譜儀（日本島津公司），蒸發(fā)光散射檢測器（Alltech ELSD3300），ODS-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，美國Agilent公司），BIY211b電子天平(日本島津公司)，AY120型十萬分之一分析天平(日本島津公司) 。所用流動相為色譜純，其余為分析純。定量分析用耐斯糖對照品（批號：11891-201202），購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 耐斯糖的含量測定

參照2010年版《中國藥典》巴戟天項下之規(guī)定，采用HPLC對樣品中耐斯糖的含量進行測定[17]，結(jié)果樣品中耐斯糖的含量范圍為3.344 0%~6.451 3%，符合《中國藥典》所規(guī)定2%以上，均勻分布。

1.2.2 采集近紅外光譜

樣品粉末4 g，裝入樣品杯，振搖并使樣品混合均勻。利用分辨率為8 cm-1的積分球漫反射系統(tǒng)進行檢測，掃描34次; 掃描范圍12000~4000 cm-1; 溫度( 23 ± 0.5 ) ℃; 相對濕度35%~40%，每批樣品重復裝樣并采集光譜5次，取平均光譜。114批樣品近紅外光譜重疊圖如圖1。

λ/cm-1

圖1 114批巴戟天的近紅外光譜重疊圖

Fig.1 Near-infrared spectra of 114How. Samples

2 結(jié)果與討論

2.1 定量分析模型的建立

根據(jù)樣品中耐斯糖含量的分布，為保證樣品集更具有代表性，要將樣品分為驗證集與校正集，其劃分的比例為4:1，并且校正集含量范圍要包含驗證集樣品含量[18]。采用TQ8.0數(shù)據(jù)分析軟件預處理光譜，利用偏最小二乘法( partial least square，PLS)作為建模方法，對校正模型進行建立，內(nèi)部驗證采用交叉驗證方法進行，用驗證集樣品檢驗校正模型的性能。校正集和驗證集樣品中耐斯糖含量情況如表1所示。

表1 校正集和驗證集中耐斯糖的含量分布（%）

2.2 光譜預處理

作為一個全息光譜，很多干擾因素，如機器噪聲、樣品顆粒和光散射等的信息存在于近紅外光譜中，對近紅外吸收強度和樣品中指標性成分數(shù)據(jù)的關系造成影響，使近紅外模型準確性與穩(wěn)定性產(chǎn)生偏差。因此，對原始光譜進行預處理是必須的。常用的預處理方法有多元散射校正法(multiplicative scatter correction，MSC)，標準歸一化法(SNV)，一階導數(shù)法(First derivative)，二階導數(shù)法(Second derivative)[19]。

本實驗采用PLS建立模型時，以內(nèi)部交叉驗證決定系數(shù)( R2) ，校正均方差( rootmean square error of calibration，RMSEC) 和預測均方差( root mean squared error of prediction，RMSEP)作為指標，用以對模型進行評價，R2越接近1，RMSEP和RMSEC 越小、表明校正模型建立越準確，RMSEP 越小，且RMSEP/RMSEC≤1.2時，表明模型能準確預測[20]。結(jié)果如表2所示。

表2 不同預處理方法對模型性能的影響

MSC可以消除基線偏移和平移現(xiàn)象，當采用該方法對光譜數(shù)據(jù)進行處理時，可得到的多元散射校正相關光譜具有高信噪比[21]。如表2所示，由于采用MSC+First Derivative方法時，R2最接近于1，因此開始時選擇該方法，但是從RMSEP/RMSEC來看，兩者比值大于1.2，故該方法并不能作為建模的預處理方法。而從MSC可看出，三個指標均符合要求，因此采用該方法對光譜進行預處理。

2.3 建模波段的選擇

由圖1可見，由于所有樣品的近紅外光譜近似，無法根據(jù)其判斷耐斯糖含量與吸光度的關系，且如果建模波段過寬，則由于包含大量冗余信息而影響模型的準確性[22]。因此對建模區(qū)間的選擇，對確定光譜與含量之間的關系是十分重要的。本實驗將所獲得的待測成分濃度與波長的吸光度進行線性回歸，將系數(shù)與對應波長作圖得到可相關光譜[23]，以R2、RMSEC、RMSEP 等為綜合考察指標，選擇合適的建模波段，通過對比，波段7502.80~4386.65 cm-1與耐斯糖含量具有較高相關性，因此選擇該波段作為建模波段可以避免采用全譜建模所導致的不準確性，因此選擇該波段為建模波段。結(jié)果見表3。

表3 不同建模區(qū)間對模型性能的影響

2.4 主因子數(shù)的選擇

數(shù)據(jù)降維，是主成分分析法的中心法則，通過變換，使幾個能夠完全表達原變量數(shù)據(jù)特征的新變量作為原變量的線性組合。這幾個新變量稱為主成分或主因子[24]。采用PLS法建立定量校正模型時，要充分利用光譜的有效信息，同時要避免發(fā)生過擬合現(xiàn)象，因此需要選擇合適的主因子數(shù)。本實驗以校正集內(nèi)部交叉驗證均方差( Root-mean-square root of cross validation，RMSECV) 為衡量模型質(zhì)量的因素，RMSECV數(shù)值越小，表示模型的預測精度高，RMSECV最小時，代表所選擇的主因子數(shù)為最佳主因子數(shù)[25]。本實驗RMSECV最小值為1.093 0，所對應的主因子數(shù)為8。結(jié)果見圖2。

圖2 RMSEC值隨主成分的變化圖

2.5 校正模型的建立

運用PLS法建立巴戟天耐斯糖含量的校正模型，圖3為建立模型的校正集樣品通過模型的交互驗證后得到的預測值與實際測量值之間的相關圖，從圖中看出，在回歸線的兩側(cè)，校正集樣品能均勻地分布。RMSEC=0.909 0，R2= 0.979 1。圖4為校正集與驗證集樣本的預測值與實測值之間的絕對偏差圖，兩個數(shù)值之間的絕對偏差在±2。

○校正樣品； + 驗證樣品

圖3 校正集樣品交互驗證得到的NIR預測值與參考值之間的相關圖

Fig.3 Relationship between reference and predictive value in calibration samples

○校正樣品； + 驗證樣品

圖4 校正集樣本與預測集樣本的NIR預測值與參考值之間的絕對偏差圖

Fig.4 Deviation between NIR value and HPLC value of calibration and validation samples

2.6 校正模型的評價

為了進一步評價校正模型，我們可以采用RPD，即相對分析誤差，其計算方法為SD/RMSECV，若RPD ≥ 3, 說明模型效果良好, 所建立的定標模型可用于檢測；如果2.5 ＜RPD ＜3, 說明可以利用所建立的模型進行定量分析, 但預測精度需要提高；如果RPD ＜2.5, 不能用近紅外光譜技術(shù)對該成分進行定量分析[26]。

本實驗所建立的定量模型RPD為3.430 9，說明所建的校正模型能應用于實際生產(chǎn)中。

棚栽果樹需要良好的光照，但大棚內(nèi)的光照強度一般只有自然條件下的60%～70%，同時，冬季自然光照時間短且強度較差，不能滿足果樹生長的需求。主要表現(xiàn)為果樹枝條生長細長、葉薄色淡，花開后，坐果率低，果實品質(zhì)差。因此，棚栽果樹要想高產(chǎn)、高效，必須要解決棚內(nèi)光照的問題。

2.7 校正模型的外部檢驗

我們需要利用驗證集樣品對模型進行外部檢驗來對校正模型的可靠性與穩(wěn)定性進行分析，本研究利用所建立的校正模型對驗證集樣品進行預測，以預測值與參考值的比值為預測回收率，研究結(jié)果見表4。

表4 驗證集樣品的平均回收率

2.8 模型的重復性考察

取5份同一樣品，分別采集其近紅外光譜圖，利用所建立好的定量分析模型對其含量進行預測，所得到的結(jié)果RSD為0.30%，表明經(jīng)過模型得到的數(shù)值重復性良好，結(jié)果見表5。

表5 NIR分析模型重復性實驗（%）

3 結(jié)論

本實驗利用近紅外光譜技術(shù)與化學計量法相結(jié)合，將巴戟天藥材樣品中的有效信息與對應樣品中耐斯糖含量進行線性擬合，建立了耐斯糖定量分析模型，經(jīng)過驗證，巴戟天藥材中耐斯糖的含量（%）按照HPLC測定的結(jié)果與近紅外光譜模型測定的結(jié)果的絕對偏差在-0.136 5與0.151 3之間，25個檢測樣品的近紅外光譜測定結(jié)果的平均回收率為100.05%，說明該模型準確、快速，適用于大批量藥材的中耐斯糖含量的快速測定，我們獲得了巴戟天藥材的近紅外光譜質(zhì)量控制方法。

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QUANTITATIVE DETERMINATION MODEL OF NYSTOSE INBY NEAR INFRARED SPECTROSCOPY

ZHOU Wen-ting, LIN Ping, WANG Hai-xia,*JI Sheng-guo

(School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou, Guangdong 510006, China)

Objective: To establish the quantitative determination model of nystose inby Near Infrared Spectroscopy (NIRS). Methods: The nystose contents of 144 samples were Mmeasured by HPLC, and their spectrum were collected. Combined with MSC and PLS, the quantitative determination model were established. Results: The determination coefficient, root-mean-square error of cross-validation, root-mean-square error of calibration and root-mean square error of prediction were 0.9791, 0.9090, 0.9090 and 1.0930 respectively in the created calibration model. Conclusion: The quantitative determination model is steady, and can determine the content rapidly and accurately.

;nystose; NIRS; quantitative determination model

1674-8085(2015)05-0094-06

O657.33

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.05.018

2015-05-19；修改日期：2015-07-19

廣東省科技計劃項目（2009B030801044）

周文婷(1988-)，女，廣東廣州人，碩士生，主要從事中藥資源開發(fā)與道地性研究(E-mail:wendychou840@163.com);

林 萍(1990-)，女，廣東湛江人，碩士生，主要從事中藥資源開發(fā)與道地性研究(E-mail: 305127358@qq.com);

王海霞(1989-)，女，海南儋州人，碩士生，主要從事中藥資源開發(fā)與道地性研究(E-mail:361123010@qq.com);

*姬生國(1967-)，男，河南新鄉(xiāng)人，教授，博士，碩士生導師，主要從事中藥資源、中藥質(zhì)量標準及中藥新藥研究(E-mail:shengguo_ji@163.com).