一株貧營養(yǎng)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選及脫氮特性

黃廷林，張麗娜，張海涵，蘇俊峰，郭琳，趙金亞，張凱

西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055

一株貧營養(yǎng)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選及脫氮特性

黃廷林*，張麗娜，張海涵，蘇俊峰，郭琳，趙金亞，張凱

西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055

為了探究并優(yōu)化菌劑應(yīng)用于微污染水源水體修復(fù)的機(jī)制和條件，主要針對水庫沉積物內(nèi)篩選出的貧營養(yǎng)好氧反硝化菌進(jìn)行了菌種鑒定及脫氮特性研究，考察菌株在不同環(huán)境條件下的脫氮效果，明確了該菌株的最適宜生長條件，并基于水庫水體中貧營養(yǎng)條件對菌株進(jìn)行水源水庫原水的馴化培養(yǎng)試驗(yàn)研究，以期實(shí)現(xiàn)該菌株對微污染水源水庫原水中氮源污染物的脫除，為原位投菌技術(shù)實(shí)際工程應(yīng)用提供理論依據(jù)。從微污染水源水庫沉積物中馴化篩分出一株高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌A14，通過掃描電鏡觀察、生理生化特征、16S rRNA基因測序和Biolog GenⅢ鑒定，確定該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，鑒定為皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii）。在好氧條件下，菌株細(xì)胞內(nèi)表達(dá)反硝化功能基因napA，以NO3-為唯一氮源進(jìn)行反硝化作用時，36 h時NO3-去除率為78.89%。以NH4+為唯一氮源時，48 h NH4+去除率為95.25%，TN去除率達(dá)80.42%，TOC去除率達(dá)98.30%，表明該菌株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性。在改變環(huán)境條件過程中，該菌株在以乙酸鈉為碳源，溫度為30 ℃，C/N為12，pH為7，接種量為10%時，NO3-去除率最高為86.62%，并且在10 ℃下脫氮率達(dá)到40.18%。在水源水庫原水脫氮實(shí)驗(yàn)中，接種處理TN去除率為50.95%，NO3-去除率為80.25%。結(jié)果表明，菌株A14在微污染水源水體菌劑脫氮修復(fù)中具有良好的應(yīng)用潛力。

異養(yǎng)硝化；好氧反硝化；微污染水源水；功能基因

近年來，我國主要飲用水水源之一——城市水庫水體的水質(zhì)污染控制受到廣泛關(guān)注。在微污染水源水處理工藝中，一些傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法并不能保證穩(wěn)定良好的污染物去除效果，相比之下，微生物處理是通過微生物群體的新陳代謝活動來去除水中的污染物，能去除傳統(tǒng)工藝難以去除的污染物，且有利于后續(xù)工藝的進(jìn)行（何斐等，2008）。其中，原位投菌技術(shù)更是以其價格低廉、高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用。

在城市飲用水的水質(zhì)安全隱患中，水源水富營養(yǎng)化占很大的比例（蘇俊峰等，2013），脫氮已成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題。而生物脫氮法由于其低耗、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且效果良好等優(yōu)勢，成為水處理過程中行之有效的方法之一。

傳統(tǒng)生物脫氮途徑主要有自養(yǎng)硝化和厭氧反硝化兩種，然而近年來，有關(guān)好氧條件下進(jìn)行反硝化作用的研究屢見報道，目前已發(fā)現(xiàn)副球菌屬（Paracoccus sp.）（劉燕等，2010），不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）（王景峰等，2011；Ren等，2014），假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)（Miyahara等，2012；Yang等，2011）和產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）（Wang等，2011；Makoto等，2014），弧菌屬（Vibrio sp.）（Duan等，2015）等多個屬的細(xì)菌具有好氧反硝化功能。Joong等（2005）篩選出的芽胞桿菌菌株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能，并且能夠在脫氮過程中將含氮化合物轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w，從而釋放氮。王兆陽等（2014）篩選出的好氧反硝化菌株GL19可以利用不同的氮源進(jìn)行快速高效的脫氮，并且具有一定的耐寒性，可以應(yīng)用于不同含氮水質(zhì)廢水的脫氮處理，對冬季的廢水脫氮處理具有一定的應(yīng)用價值，上述研究均表明了研究在向?qū)嶋H應(yīng)用逐漸發(fā)展。目前篩選出的好氧反硝化菌雖然都具有良好的脫氮性能（喬森等，2014），然而多數(shù)菌種只能在高C/N下生長良好，因此在廢水處理中應(yīng)用很多（陳茂霞等，2013），而關(guān)于微污染水源水的微生物脫氨相關(guān)研究工作卻鮮見報道。因?yàn)槲⑽廴舅w具有較低的C/N，且存在季節(jié)更迭的溫度變化，能夠在貧營養(yǎng)以及低溫條件下生長的菌種對于微污染水體處理具有重要的理論和工程應(yīng)用價值（蘇俊峰等，2013）。

目前，新型的生物脫氮技術(shù)——異養(yǎng)硝化-好氧反硝化已成為生物脫氮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它可以在空間和時間上同步完成硝化反硝化兩個過程，將原本兩個獨(dú)立的環(huán)節(jié)結(jié)合在一起，微生物在去除氮的同時，也消耗了有機(jī)碳，同時降低碳和氮（喬森等，2014；陳茂霞等，2013），這對于自然水庫和湖泊環(huán)境條件下的微污染水體尤其適用。本研究從山東棗莊周村微污染水源水庫沉積物中馴化分離出一株高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株 A14，通過 16S rRNA基因鑒定確定分類地位，進(jìn)一步研究該菌的脫氮特性，通過逐步馴化培養(yǎng)，在微污染水源水庫原水中考察其脫氮效果，以期實(shí)現(xiàn)該菌株在微污染水源水菌劑脫氮工程應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

選擇性反硝化培養(yǎng)基（1WP）：NaAc 0.1 g·L-1、NaNO30.02 g·L-1、K2HPO40.02 g·L-1、CaCl20.01 g·L-1、MgCl20.01 g·L-1（黃廷林等，2013）；BM培養(yǎng)基：NaAc 0.1 g·L-1、NaNO30.02 g·L-1、K2HPO40.02 g·L-1、CaCl20.01 g·L-1、MgCl20.01 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1（黃廷林等，2013）；異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（1WX）：NaAc 0.15 g·L-1、NH4Cl 0.014 g·L-1、K2HPO40.04 g·L-1、CaCl20.02 g·L-1、MgCl20.02 g·L-1（魏巍等，2010）；菌種鑒定BUG+B培養(yǎng)基的制備：取0.57 g BUG培養(yǎng)基粉加入95 mL蒸餾水，高溫高壓蒸汽滅菌，取 SM0101凍干脫纖維羊血（北京友康科技有限公司），加入5 mL無菌水稀釋，待BUG培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃，加入稀釋后的脫纖維羊血，在超凈工作臺中倒入平板以備使用。

1.2 菌株A14的篩選

參考魏巍等（2010）的方法，取適量水庫沉積物樣品加入1WP培養(yǎng)基中，置于250 mL錐形瓶中，在30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以120 r·min-1持續(xù)振蕩，培養(yǎng)液濃度每5 d按初始濃度的10%遞減。經(jīng)1個月的富集馴化后，搖勻，取泥水混合液采用平板梯度稀釋法進(jìn)行分離純化，即在10-1、10-2、10-3、10-4梯度下在BM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，通過形態(tài)觀察比較，篩選出生長良好、有代表性的反硝化菌，挑取單菌落在BM培養(yǎng)基上再進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，重復(fù)5～6次，最終分離純化出單一菌株，將其-20 ℃低溫保存在甘油中。將純化后的單一菌株接種于1WP培養(yǎng)基中48 h后，測定TN、NO3-、NO2-及NH4+濃度變化，根據(jù)去除效果挑選出優(yōu)勢菌種進(jìn)行深入研究（魏巍等，2010）。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株A14接種于5倍濃度1WP培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中120 r·min-1下培養(yǎng)24 h后，取10 mL于10000 r·min-1條件下離心15 min，使用2.5%戊二醛固定24 h后，通過高分辨冷場發(fā)射掃描電鏡拍攝觀察菌體特征和細(xì)胞個體形態(tài)（陳茂霞等，2013）。

1.3.2 生理生化分析

菌株生理生化特性依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行分析（Holt等，1994）。

1.3.3 DNA提取與16S rRNA基因測序

DNA提取步驟如下：取菌液離心后，加 PBS洗滌，于1200 r·min-1離心，棄去上清液，重復(fù)洗滌3次，離心后，加2 mL TE重懸，取0.8 mL上述樣品與0.8 mL DNA提取液混合，加入200 μL蛋白酶K，置于搖床內(nèi)反應(yīng)20 min，設(shè)置條件為225 r·min-1，37 ℃。最后加入200 μL SDS，置于溫度65 ℃水浴1.5 h，間隔20 min輕輕搖動數(shù)次（Zhou等，1996）。

采用由美國英杰Invitrogen（上海）公司合成的引物，其中正向引物 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Mastermix 25.0 μL，正向引物27F（10 μm）1.0 μL，反向引物1492R（10 μm） 1.0 μL，ddH2O22 μL，模板DNA1.0 μL（Chun等，2007）。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min（Zhou等，1996）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100 V下電泳1 h，GelRed染色10 min，在凝膠成像系統(tǒng)下成像拍照，確定擴(kuò)增條帶（Zhou等，1996），割膠回收、純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序分析。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結(jié)果提交至NCBI，通過Blast檢索進(jìn)行比對，搜索同源性序列，根據(jù)已有研究結(jié)果，采用MEGA5軟件對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（趙丹等，2013；林娜等，2012），進(jìn)化距離計(jì)算方法為最大似然法（全向春等，2007）。

1.3.5 Biolog菌種鑒定

參考李雯等（2014）的方法，取已純化菌株A14在BM培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)2代后，將單菌落轉(zhuǎn)接至BUG+B固體培養(yǎng)基，30 ℃連續(xù)培養(yǎng)2代。在無菌條件下，使用Inoculatorz棉簽從平板中沾取直徑3 mm的菌落，調(diào)節(jié)濁度至95%～98%，接種至GENⅢ微孔板中，33 ℃下培養(yǎng)3～36 h，讀板確定鑒定結(jié)果。相似性（SIM）和位距（DIS）作為BIOLOG鑒定中重要的參數(shù)，來共同表征鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的匹配度。在BIOLOG系統(tǒng)中：培養(yǎng)16～24 h， SIM≥0.5，DIST<5.0時，系統(tǒng)自動給出鑒定結(jié)果（李雯等，2014）。

1.4 周質(zhì)硝酸還原酶(napA)的擴(kuò)增

參考修海峰等（2011）的方法，napA擴(kuò)增所用引物：其中正向引物 NAP1：5’-TCTGGACCATGG-GCTTCA ACCA-3’，反向引物NAP2：5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’，反應(yīng)體系為：2×PCR Mix（100 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1Tris-HCl，3 mmol·L-1MgCl2，400 μmol·L-1dNTP混合液，TaqDNA聚合酶），12.5 μL；DNA模版，1 μL；上述引物各1 μL；加去離子水至體積為25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s；65 ℃，30 s；72 ℃，1 min，進(jìn)行20個循環(huán)；72 ℃延伸7 min（王兆陽等，2014）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳45 min，GelRed染色10 min，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。

1.5 脫氮特性測定

參考孫雪梅等（2012）的方法，并稍作改進(jìn)。平板接種單菌落 A14至滅菌 1WP培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，120 r·min-1活化24 h后，接10%菌液分別至滅菌1WP、1WX培養(yǎng)基中，測定6、12、24、48、72 h的TN、NO3-、NO2-、NH4+、TOC質(zhì)量濃度變化，測定設(shè)置3個平行（n=3）。

1.6 好氧反硝化特性影響因素分析

參考韓永和等（2013）的方法，并稍作改進(jìn)。接10%菌液分別至不同碳源、不同C/N、不同pH、不同溫度、不同接菌量的相應(yīng)培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，不同條件下培養(yǎng)48 h，測定NO3-、NO2-質(zhì)量濃度變化，每種影響因素下設(shè)置 3個平行（n=3）。研究在不同因素條件下，菌株A14對NO3-的去除能力。

1.7 菌株馴化及其在原水中脫氮性能研究

參考魏巍等（2010）的方法，接種菌株A14至100 mL滅菌5倍濃度1WP培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，接10%菌液至100 mL滅菌水庫原水中，對菌株進(jìn)行逐步馴化，即在30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，120 r·min-1振蕩培養(yǎng) 48 h，使之適應(yīng)微污染水源水庫原水的貧營養(yǎng)環(huán)境。接 10%馴化適應(yīng)后菌液至 100 mL水庫原水中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，120 r·min-1振蕩條件下，測定2、3、4、5 d的TN、NO3-質(zhì)量濃度，測定設(shè)置 3個平行。TN、NO3-、NO2-、NH4+濃度采用德國SEAL AA3流動分析儀測定（全向春等，2007），pH值采用哈希pH儀（HQ-11d）測定，DO采用哈希溶解氧儀（HQ-14d）測定，OD600由日本島津分光光度計(jì)（UVmini-1240），TOC濃度采用日本島津TOC儀（TOC-L CPN）測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1菌株A14的形態(tài)特征和生理生化特性

在BM培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察菌落為半透明、較小、圓形、邊緣整齊、表面凸起、濕潤、透過光線菌落有熒光。掃描電鏡下觀察，菌株A14呈短桿狀、菌體較小、約0.9 μm×1.0 μm、無鞭毛、無芽孢，菌株的具體細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。

菌株A14的生理生化檢測結(jié)果如表1所示。

圖1 菌株A14的掃描電鏡照片(20000×)Fig. 1 Scanning Electron Microscope (SEM) of A14 strain(20000×)

表1 菌株A14的生理生化特征解析Table 1 Chemical and physical characteristics of A14 strain

2.1.2 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株A14的DNA為模板，27F、1492R為引物，PCR擴(kuò)增得到一條約1500 bp的特征條帶，并測定了其序列。經(jīng)16S rRNA基因測序及同源性比較，結(jié)合常規(guī)生理生化鑒定，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌A14與多株皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii）的相似性水平在97%以上，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征，確定分離的菌株A14為皮特不動桿菌（A. pittii）。將該菌株與同源性高的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹（圖2）。

圖2 基于16S rRNA序列同源性構(gòu)建菌株A14的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Unrooted phylogenetic trees based on the 16S rRNA sequences of strain A14

2.1.3 功能基因(napA)擴(kuò)增

利用引物NAP1/NAP2對A14菌株的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到870 bp左右處清晰的目標(biāo)條帶（圖3）。根據(jù)Cindy等（2007）的研究可知，周質(zhì)NAR的亞基napA基因均在870 bp左右，因此可初步判斷，該菌含有napA基因。周質(zhì)硝酸還原酶（napA）是一種在有氧條件下發(fā)揮作用的酶，在反硝化作用中，它使某類細(xì)菌可以利用硝酸鹽和亞硝酸鹽分子中結(jié)合更緊密的氧原子作為最終電子受體，因此，napA可以被作為菌株具有好氧反硝化功能的依據(jù)（陳茂霞等，2013；修海峰等，2011）。表明菌株A14細(xì)胞具有在好氧條件下表達(dá)反硝化功能基因的功能。

圖3 A14的napA基因PCR擴(kuò)增Fig. 3 Amplification of napA in strain A14 by PCR

2.1.4 菌株A14的Biolog鑒定結(jié)果

表2為菌株A14在培養(yǎng)20 h時的BIOLOG鑒定結(jié)果。結(jié)果顯示：該菌對葡萄糖、果糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸等碳源代謝程度高，與數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌株代謝指紋比對后，鑒定該菌為Acinetobacter pittii，與16S rRNA測序鑒定結(jié)果一致。

表2 菌株A14的Biolog鑒定結(jié)果Table 2 Biolog’s identification result of strain A14

2.2 菌株A14的脫氮特性分析

2.2.1 菌株A14的好氧反硝化特性

當(dāng)NO3-為唯一氮源時，由圖4A可看出，12 h的 TN去除率和 NO3-去除率分別為 10.11%和17.64%，12～36 h為對數(shù)生長期，其中24 h的NO3-去除率達(dá)到最大值78.89%，36 h的TN去除率達(dá)到最大值 57.60%，可看出脫氮主要發(fā)生在對數(shù)生長期。在觀測的72 h內(nèi)，NO2-積累量很小，在對數(shù)生長期時，達(dá)到 0.33 mg·L-1，之后逐漸降低至 0.09 mg·L-1，說明該菌在脫氮過程中無明顯NO2-積累。12和36 h的TOC去除率分別為18.93%和88.66%，隨著 TOC的降低，培養(yǎng)基內(nèi)碳源不足，該菌株進(jìn)入衰亡期，不再進(jìn)行脫氮過程，氮質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，TOC與NO3-質(zhì)量濃度降解趨勢有一致性。

圖4 不同氮源條件下菌株A14脫氮特性Fig. 4 Nitrogen removal of strain A14 with different nitrogen as the sole nitrogen sources

2.2.2 菌株A14的異養(yǎng)硝化特性

當(dāng)NH4+為唯一氮源時，該菌脫氮效果明顯。由圖4-B可看出，12 h的TN去除率和NH4+去除率17.23%和7.82%，12～48 h為對數(shù)生長期，其中48 h的氮去除率達(dá)到最大值，TN去除率達(dá)到80.42%，NH4+去除率達(dá)到 95.25%，TOC的去除率達(dá)到92.1%，說明發(fā)生了異養(yǎng)硝化作用。48 h后，TOC濃度降至3.68 mg·L-1，培養(yǎng)基內(nèi)碳源不足，菌株進(jìn)入衰亡期，氮含量無顯著變化。

整個脫氮過程中，無NO2-積累，也無明顯NO3-積累，說明該菌同時進(jìn)行著硝化和反硝化反應(yīng)，這與周迎芹（2013）、趙丹等（2013）的研究結(jié)果相似。目前，Richardson等（1989）提出的關(guān)于異養(yǎng)硝化的脫氮假想途徑已得到廣泛認(rèn)可，即NH4+經(jīng)過氨單加氧酶（AMO）氧化為羥胺，羥胺在羥胺氧化酶（HAO）作用下有兩種轉(zhuǎn)化方式（林娜等，2012），方式一是轉(zhuǎn)變?yōu)镹O3-和NO2-，肖繼波（2012）、孫雪梅等（2012）人的研究結(jié)果與之相似；方式二是直接轉(zhuǎn)變?yōu)?N2O、N2。由于實(shí)驗(yàn)過程中未檢測到NO3-和 NO2-生成，因此推測菌 A14的異養(yǎng)硝化途徑屬于方式二。

2.3 好氧反硝化特性研究

2.3.1 碳源對菌株A14好氧反硝化特性的影響

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化是氧化還原反應(yīng)，碳源在菌株的生長過程中可以提供必要的能源和電子供體，進(jìn)而影響反應(yīng)的進(jìn)行，不同的碳源具有不同的氧化還原電位，因此，也會產(chǎn)生不同的脫氮效果（喬森等，2014；蘇婉昀等，2013）。本實(shí)驗(yàn)選取葡萄糖、草酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸三鈉、乙酸鈉5種不同碳源，研究不同碳源條件對菌株A14的脫氮性能的影響，如圖 5所示。可以看出，碳源對 NO3-去除率有一定的影響，當(dāng)以乙酸鈉為唯一碳源時，NO3-去除率可以達(dá)到86.62%，明顯高于其他碳源培養(yǎng)基，略有NO2-積累；當(dāng)以檸檬酸三鈉和丁二酸鈉為唯一碳源時，NO3-去除率為59.59%和59.96%；而以葡萄糖、草酸鈉為唯一碳源時，NO3-去除率相對較低。因此，菌株A14在以乙酸鈉為碳源時，脫氮效果最好，這可能是由于乙酸鈉的分子量較小，容易被細(xì)胞吸收代謝。

圖5 碳源對菌株A14好氧反硝化特性的影響Fig. 5 Effect of carbon source on denitrification of strain A14

2.3.2 C/N對菌株A14好氧反硝化特性的影響

不同碳氮比對菌株 A14好氧反硝化特性的影響如圖6所示。其中，碳氮比（C/N）中C指代乙酸鈉中碳質(zhì)量濃度，N指代硝酸鈉中氮質(zhì)量濃度，可以看出，碳氮比對菌株 A14的脫氮效果影響很大，當(dāng)C/N=8時，菌株A14的NO3-去除率為86.62%，當(dāng)C/N達(dá)到16時，NO3-可以完全去除，且無NO2-積累。當(dāng)C/N=20時，NO3-去除率反而有所下降，所以該菌株的最適C/N為16。這與王弘宇等（2007）的研究結(jié)果一致，即充足的碳源可以提供充足的電子流，進(jìn)而提供充足的能源供菌體生長，但當(dāng)碳源量大于菌體所需量時，脫氮率基本不再受C/N影響（王弘宇等，2007）。

圖6 C/N對菌株A14好氧反硝化特性的影響Fig. 6 Effect of C/N on denitrification of strain A14

低C/N條件時，雖然NO3-去除率有所降低，但當(dāng)C/N=5時，該菌株的NO3-去除率仍然可以達(dá)到60%，這說明菌株A14在低C/N下也有一定的NO3-去除能力，這使該菌在微污染水源水脫氮修復(fù)中具有實(shí)際工程應(yīng)用價值。

2.3.3 pH對菌株A14好氧反硝化特性的影響

由于氫離子濃度不同會引起微生物細(xì)胞膜電荷的變化，進(jìn)而決定微生物攝取營養(yǎng)物質(zhì)的能力（王弘宇等，2007），因此pH是影響微生物活性的重要指標(biāo)之一（周迎芹等，2013）。圖7描述了pH對菌株A14脫氮效果的影響，當(dāng)pH為7時，菌株A14的NO3-去除效果最佳，而當(dāng)環(huán)境條件偏酸或偏堿時，其NO3-去除率有所下降，在不同pH條件下，NO2-積累均不明顯，說明菌種A14最適宜生長酸堿條件為中性。

圖7 pH對菌株A14好氧反硝化特性的影響Fig. 7 Effect of pH on denitrification of strain A14

Timmermans等（1983）研究顯示，反硝化酶活性的最適pH值是中性或微堿性，否則微生物中反硝化酶的活性會有所抑制，進(jìn)而影響脫氮效果，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

2.3.4 溫度對菌株A14好氧反硝化特性的影響

溫度對菌株A14脫氮效果的影響如圖8所示。溫度過高或過低，微生物的好氧反硝化酶活性都會受到影響，從而改變脫氮效果。本實(shí)驗(yàn)考察了在低中高（10、20、30、35、45 ℃）不同溫度條件下的脫氮特性，可以看出，當(dāng)溫度在 30 ℃時，NO3-去除率最大，可以達(dá)到86.62%，說明該菌株的最適溫度為30 ℃。在10 ℃下，該菌株的NO3-去除率可以達(dá)到40.18%，在45 ℃下，NO3-去除率卻只有12.78%，但低溫條件下，NO2-積累量高于中高溫條件。這說明該菌株在低溫條件下可以生長，但無法適應(yīng)高溫條件。

圖8 溫度對菌株A14好氧反硝化特性的影響Fig. 8 Effect of temperature on denitrification of strain A14

這是因?yàn)榈蜏貤l件下，酶活性會受到抑制，高溫條件下，微生物的蛋白質(zhì)會變性從而使酶系統(tǒng)失活（周莉等，2013）。所以該實(shí)驗(yàn)說明，菌株 A14的好氧反硝化酶最適溫度為 30 ℃，且可以適應(yīng)適當(dāng)?shù)牡蜏貤l件。

圖9 接菌量對菌株A14好氧反硝化特性的影響Fig. 9 Effect of inoculating ratio on denitrification of strain A14

2.3.5 菌劑投加量對菌株A14好氧反硝化特性的影響

韓永和等（2013）研究發(fā)現(xiàn)NO3-去除率與好氧反硝化菌接種量有直接關(guān)系，因此考察了不同接菌量對好氧反硝化特性的影響。由圖9可以看出，當(dāng)接菌量>0.1%時，NO3-去除率可以達(dá)到 60%以上，當(dāng)接菌量為5%時，NO3-去除率接近80%，當(dāng)接菌量為10%時，NO3-去除率達(dá)到最大值86.62%，而當(dāng)接菌量為15%時，NO3-去除率反而有所下降，且有明顯NO2-積累。這與蘇俊峰等（2013）人的結(jié)論一致，貧營養(yǎng)條件下，接菌量過低無法實(shí)現(xiàn)高效反硝化；而接菌量過高時，則無法滿足微生物生長數(shù)量所需營養(yǎng)物質(zhì)，否則死亡的菌體會發(fā)生自溶現(xiàn)象，進(jìn)而釋放胞內(nèi)有機(jī)氮。

2.4 菌株A14在微污染水源水庫原水中的貧營養(yǎng)馴化脫氮實(shí)驗(yàn)

依照實(shí)驗(yàn)步驟2.8在5倍濃度1WP培養(yǎng)基、滅菌水庫原水中依次對菌株A14進(jìn)行培養(yǎng)、馴化，使之能夠在短時間內(nèi)適應(yīng)貧營養(yǎng)環(huán)境條件，然后接種至微污染水源水庫原水（原水取自山東棗莊某水庫，水質(zhì)指標(biāo)如表3所示）中，考察A14對實(shí)際水源水中氮污染物的脫除效果。

表3 山東棗莊某水源水庫水質(zhì)指標(biāo)Table 3 The water quality of reservoir in Zaozhuang, Shandong Province

如圖10所示，接種到水庫原水中48 h時，TN質(zhì)量濃度由初始值1.736 mg·L-1降至1.042 mg·L-1，TN去除率達(dá)到 39.98%，NO3-質(zhì)量濃度由初始值1.223 mg·L-1降至 0.629 mg·L-1，NO3-去除率達(dá)到48.57%，接種120 h時，TN最終去除率達(dá)到50.95%，NO3-最終去除率達(dá)到80.25%。在水庫原水的脫氮過程中，NO3-和TN均有明顯的去除率，說明該菌株在逐步馴化培養(yǎng)過程中，具有良好的脫氮效果。

圖10 山東棗莊某水庫原水中菌株A14脫氮情況Fig. 10 Nitrogen removal of strain A14 in raw water of reservoir in Zaozhuang, Shandong Province

由于本次研究中采用的菌株 A14是從山東棗莊某水庫沉積物中篩選所得，將其應(yīng)用至該水庫原水脫氮中，不易產(chǎn)生生態(tài)風(fēng)險，并且更容易與土著菌結(jié)合，形成更加有效的復(fù)合菌群。因此，菌株A14在微污染水源水脫氮處理中的應(yīng)用具有良好應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

1）從貧營養(yǎng)水源水庫沉積物中篩選出好氧反硝化菌A14，菌落形態(tài)為短桿菌，菌落為半透明，菌體較小，約0.9 μm×1.0 μm，無鞭毛，無芽孢，革蘭氏陰性。16S rRNA基因測序、Biolog GenⅢ鑒定和生理生化分析確定菌株 A14為皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii），并且胞內(nèi)表達(dá)napA基因，表明該菌可以在好氧條件下進(jìn)行反硝化作用。

2）對篩選出的菌株A14進(jìn)行脫氮特性研究，發(fā)現(xiàn)該菌株同時具備好氧反硝化和異養(yǎng)硝化能力，在以NO3-為氮源的培養(yǎng)基中，菌株A14的NO3-去除率達(dá)到 78.89%，TN去除率達(dá)到 57.60%；在以NH4+為氮源的培養(yǎng)基中，菌株A14發(fā)生了同步硝化-反硝化作用，TN去除率達(dá)到83.53%，NH4+去除率達(dá)到95.25%。在兩脫氮過程中，該菌均無NO2-積累。

3）在好氧反硝化特性研究中，通過對不同影響因素分析，得到菌株A14的最適宜生長條件為：以乙酸鈉為碳源，溫度為30 ℃，C/N為16，pH為7，接菌量為10%。并且該菌株在10 ℃下NO3-去除率可以達(dá)到40.18%，在C/N=5時，NO3-去除率可以達(dá)到60%，說明該菌可以在低溫、低C/N條件下生長。

4）采用逐步馴化培養(yǎng)法，將菌株A14經(jīng)過5倍濃度 1WP培養(yǎng)基和滅菌水庫原水的馴化培養(yǎng)后，接菌液接種至水庫原水中培養(yǎng)，120 h時TN去除率達(dá)到50.95%，NO3-去除率達(dá)到80.25%，證明該菌株在貧營養(yǎng)水庫原水中適應(yīng)性良好，具有明顯的脫氮效果，可作為微污染水源水脫氮過程的高效菌劑。

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Screening and Nitrogen Removal Characteristics of A heterotrophic Nitrification-aerobic Denitrification Strain

HUANG Tinglin*, ZHANG Lina, ZHANG Haihan, SU Junfeng, GUO Lin, ZHAO Jinya, ZHANG Kai
School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture & Technology, Xi’an 710055, China

To investigate the feasibility that the strain can used to treat micro-polluted water, the research is mainly about the identification and the denitrification characteristics of the aerobic-denitrification strain that was isolated from sediment in water reservoir and the effects of nitrogen removal under different environmental factors. The optimal conditions of the strain can be determined. Through the method of cultivation and acclimatization to make the strain adapt to the oligotrophic condition and make effects on nitrogen removal, which all prove a theoretical basis for the practical application of onsite biological treatment in the future. A high efficient heterotrophic nitrification-denitrification aerobic bacteria (A14) was isolated from sediment in water reservoir. Based on its microscopic observation, biochemical/morphological characteristics, its 16S rRNA sequence homologic analysis and Biolog GenⅢ identification, this strain was a gram-negative bacillus and was identified as Acinetobacter pittii. The efficient nitrogen removal in 36 hours can be 78.89% when nitrogen as the nitrogen source and the strain’s partial napA functional gene was cloned. When ammonia as the nitrogen source, TN removal rate can be 80.42%, ammonia removal rate can be 95.25%, TOC removal rate can be 98.3%. The highest nitrite removal rate reaches 86.62% when carbon resource is NaAc, temperature=30 ℃, C/N=12, pH=7, inoculating ratio is 10%. In addition, the nitrite removal rate can reach 40.18% under 10 ℃. When the strain is cultivated and acclimated in reservoir raw water, TN removal can be 50.95%, the nitrogen removal can be 80.25%. It is therefore demonstrated that the strain A14 can be used to treat micro polluted water.

heterotrophic nitrification; aerobic denitrification; micro polluted water; functional genes

X172

A

1674-5906（2015）01-0113-08

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.01.017

黃廷林，張麗娜，張海涵，蘇俊峰，郭琳，趙金亞，張凱. 一株貧營養(yǎng)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選及脫氮特性[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2015, 24(1): 113-120.

HUANG Tinglin, ZHANG Lina, ZHANG Haihan, SU Junfeng, GUO Lin, ZHAO Jinya, ZHANG Kai. Screening and Nitrogen Removal Characteristics of A Heterotrophic Nitrification-aerobic Denitrification Strain [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(1): 113-120.

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC04B02）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51208413）

黃廷林（1962年生），男，教授，博士，主要研究方向?yàn)樗此畮焖|(zhì)微污染控制。E-mail:huangtinglin@xauat.edu.cn；*通訊作者

2014-11-06