精氨酸聯(lián)合加味大柴胡湯對(duì)急性膽管炎大鼠肝臟功能的保護(hù)作用

謝 毅，張 超

河南省人民醫(yī)院腹腔鏡治療研究中心鄭州450003

△男，1978年9月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向:肝膽疾病，E-mail:174171368@qq．com

急性膽管炎在臨床上很常見，其治療的根本在于去除病因、解除梗阻、通暢引流。精氨酸(arginine，Arg)可調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能，有減輕炎癥反應(yīng)的作用［1］。大柴胡湯中加入茵陳、金錢草等藥能清熱利濕退黃，保護(hù)肝臟功能［2］。TLR4 是介導(dǎo)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)反應(yīng)的細(xì)胞表面特異性受體。LPS與TLR4 結(jié)合能激發(fā)下游傳導(dǎo)途徑，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，激發(fā)炎癥發(fā)生的過程［3］。該研究觀察了精氨酸聯(lián)用加味大柴胡湯對(duì)急性膽管炎大鼠肝組織TLR4 的影響，探討TLR4 在急性膽管炎中的作用，為臨床上治療急性膽管炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物來源、藥物與試劑 動(dòng)物來源:SD 大鼠90只，雌雄不拘，體重220～250 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。加味大柴胡湯方劑組成:柴胡、黃芩、白芍、半夏、綿茵陳、枳實(shí)、大黃、大棗、生姜、金錢草、木香。藥液制備:加味大柴胡湯生藥加水(m生藥∶m水=1∶4)浸泡，加熱煮沸，文火煎煮1 h，趁熱過濾;同法再煮2次，合并3次濾液，文火濃縮至含生藥量1 g/mL，－20℃冷藏備用，實(shí)驗(yàn)中按照人和大鼠體表面積折算的劑量經(jīng)口灌藥［4］。Arg 購自杭州紐曲星生物科技有限公司。大鼠TLR4 引物及其GAPDH 內(nèi)參引物(廣州達(dá)暉生物公司)，鱟試劑盒(廣東湛江安度司生物有限公司)。兔抗人TLR4 多克隆抗體及SP 試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)分組與標(biāo)本采取 90只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組:對(duì)照組、西藥組、中藥組、聯(lián)合組和假手術(shù)組，每組18只。前4組大鼠制備膽道急性感染模型［2］:在膽總管距離左右肝管匯合處1 cm 以遠(yuǎn)剪開膽總管，遠(yuǎn)端雙線結(jié)扎，近端插入麻醉導(dǎo)管，深度約6 mm。向管內(nèi)注入0．5 mL 大腸桿菌O111B4 內(nèi)毒素，生理鹽水稀釋至5 ×109CFU/mL，肝素帽封閉導(dǎo)管。對(duì)照組術(shù)后6 h 給予生理鹽水(2 mL/次，2次/d)灌胃，西藥組術(shù)后即給予Arg 300 mg/kg，中藥組術(shù)后6 h 給予加味大柴胡湯(2 mL/次，2次/d)灌胃，聯(lián)合組術(shù)后即給予Arg、術(shù)后6 h 給予加味大柴胡湯(方法用量同上)。各組分別于分組處理后24、48、72 h 取6只大鼠，用氯氨酮(100 mg/kg)靜脈麻醉后開腹，取門靜脈血標(biāo)本和肝組織備用。

1．3 血清TB 水平檢測 取2 mL 門靜脈血，采用全自動(dòng)血生化分析儀測定血清TB 水平。

1．4 血漿內(nèi)毒素水平檢測 抽1 mL 門靜脈血，內(nèi)毒素測定采用鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法。

1．5 肝組織TLR4 mRNA 表達(dá)的檢測 采用RTPCR 法。取100 mg 肝組織，按照試劑盒(Qiagen 公司)說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。TLR4(264 bp)引物序列:上游5’-CACCCTCGAGTGGGAGGA CA-3’，下 游5’-CCTGTGAGGTCGTTGAGGTT-3’;GAPDH(272 bp)引物序列:上游5’-GGTGATGCT GCTGAGTA-3’，下 游:5 ’-ACTGTGGTCATGAGC CCTTC-3’。PCR 反應(yīng)體系:總體積25 μL，模板cDNA 3．0 μL，QIAGEN ONE Step Buffer 5 μL，上、下游引物各1．5 μL、dNTP Mix 1 μL，QIAGN One Step RT-PCR Enzyme Mix 1 μL 和PCR 水12 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃45 s;49．7℃1 min，72℃1 min 或50℃30 min(GAPDH)，95℃15 min，35個(gè)循環(huán);72℃10 min。PCR 產(chǎn)物用15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用捷達(dá)801 凝膠成像分析系統(tǒng)觀察各擴(kuò)增條帶的光密度值，計(jì)算TLR4 和GAPDH 擴(kuò)增條帶平均光密度的比值，即TLR4 mRNA 的表達(dá)量。

1．6 肝組織TLR4 蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化法。標(biāo)本經(jīng)40 g/L 多聚甲醛溶液固定。免疫組化主要步驟:5 μm 厚的肝組織石蠟切片脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)，PBS 沖洗5 min;滴加100 μL 過氧化氫，室溫孵育20 min，PBS 沖洗3次;滴加一抗(按1∶500 稀釋)，4℃冰箱過夜，PBS 沖洗3次，滴加山羊抗兔IgG 抗體，室溫孵育20 min，PBS 水沖洗3次。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，50℃恒溫烤箱處理30 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結(jié)果判斷:以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈棕黃色或棕黃褐色為陽性。陽性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。0 分:陰性，與背景色完全一致;1 分:弱陽性染色，呈淡黃色或略深于背景色;2 分:陽性染色，呈中等黃色或深于背景色;3 分:強(qiáng)陽性染色，呈棕黃色或棕褐色。每張切片取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞率。0 分:陽性細(xì)胞率≤10%;1 分:陽性細(xì)胞率＞10%～;2 分:陽性細(xì)胞率26%～;3 分:陽性細(xì)胞率＞50%。兩項(xiàng)評(píng)分相加，＜1 分為無表達(dá)(－)，1～2分為低表達(dá)(+)，3～4 分為中度表達(dá)()，5～6 分為高表達(dá)()。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS 8．1 處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較5組大鼠血清TB 水平、血漿內(nèi)毒素水平及肝組織TLR4 mRNA 表達(dá)水平的差異，組間比較采用SNK-q 檢驗(yàn);采用行×列表的χ2檢驗(yàn)比較5組大鼠肝組織TLR4 蛋白表達(dá)強(qiáng)度的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠血清TB 水平的測定結(jié)果 見表1。與假手術(shù)組相比，其他4組不同時(shí)間點(diǎn)TB 升高;其他4組中，聯(lián)合組血清TB 水平最低。

2．2 各組大鼠血漿內(nèi)毒素的變化 結(jié)果見表2。與假手術(shù)組相比，其他4組不同時(shí)間點(diǎn)血漿內(nèi)毒素升高;其他4組中，聯(lián)合組血漿內(nèi)毒素最低。

2．3 各組大鼠肝組織中TLR4 mRNA 的表達(dá) 結(jié)果見表3。與假手術(shù)組相比，其他4組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝組織中TLR4 mRNA 的表達(dá)水平升高;其他4組中，聯(lián)合組TLR4 mRNA 的表達(dá)水平最低。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TB 的測定結(jié)果(n=6) U/L

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿內(nèi)毒素的變化(n=6) EU/mL

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA 的表達(dá)比較(n=6)

2．4 各組大鼠肝組織中TLR4 蛋白的表達(dá) 結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝組織TLR4 蛋白的表達(dá)比較例

3 討論

急性膽管炎是指細(xì)菌感染所導(dǎo)致的膽道系統(tǒng)的急性炎癥。細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)過度釋放、促炎介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的失衡，炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活在炎癥反應(yīng)中起到重要的作用［5］。

急性膽管炎發(fā)病過程中，TLR4 作為炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路中的調(diào)控分子起著重要作用。血TLR4 介導(dǎo)內(nèi)毒素引起的先天免疫系統(tǒng)激活和炎癥因子釋放［6］。相關(guān)研究［7］表明，炎癥因子釋放的程度與TLR4 表達(dá)量呈正相關(guān)，因而炎癥反應(yīng)的劇烈程度可以通過TLR4 表達(dá)量的多少來反映。該研究結(jié)果顯示，在分組處理后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，聯(lián)合組中TLR4 mRNA 和蛋白的表達(dá)較中藥組和西藥組減弱，提示中、西藥聯(lián)合作用下肝臟的炎性損傷與其他組比較明顯減輕。

加味大柴胡湯中的大黃成分能夠減輕內(nèi)毒素引起的腸壁血管通透性升高，阻止腸腔中的細(xì)菌和毒素進(jìn)入血液循環(huán)，從而抑制腸道細(xì)菌易位，減輕炎癥反應(yīng)和炎性損傷［8］。有研究［8-9］表明，大黃可以清除體內(nèi)氧自由基和降低血清中內(nèi)毒素水平從而抑制炎癥反應(yīng)。Arg 是一種T 細(xì)胞刺激因子，在急性膽管炎圍手術(shù)期補(bǔ)充Arg 能夠激活T 淋巴細(xì)胞，因而能清除活性氧自由基，減輕肝臟損傷和炎癥反應(yīng)，預(yù)防炎癥引起的肝硬化，從而起到保護(hù)肝臟的作用［10］。內(nèi)毒素的檢測作為血液細(xì)菌培養(yǎng)的輔助檢查能夠提示膽道感染。血清TB 是反映肝功能的指標(biāo)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示處理后24、48 和72 h，雖然與假手術(shù)組相比，西藥組、中藥組和聯(lián)合組大鼠血漿內(nèi)毒素水平和血清TB 水平升高，但聯(lián)合組血漿內(nèi)毒素水平和血清TB 水平較西藥組和中藥組降低，提示中西藥聯(lián)合緩解肝臟炎癥損傷的療效好于單純中藥組或西藥組。

總之，加味大柴胡湯和Arg 可能是通過抑制炎癥因子、減輕炎癥反應(yīng)，從而下調(diào)TLR4 的表達(dá)，切斷了部分炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路，減弱了由TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，因而減輕肝臟的損傷，為臨床上應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合的方法治療膽管炎提供了依據(jù)。

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