不同正畸力對(duì)大鼠牙周組織張力側(cè)BMP-2蛋白表達(dá)的影響*

常 悅，王明潔，王月，張小平，崔淑霞

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州450052 2)河南省口腔醫(yī)院正畸科 鄭州450052

生理狀態(tài)下牙周組織處于成骨和破骨的動(dòng)態(tài)平衡之中，在正畸力作用下牙周組織發(fā)生適應(yīng)性改建，壓力側(cè)破骨細(xì)胞增生活躍，以骨吸收為主，張力側(cè)成骨細(xì)胞增生活躍，以骨生成為主。正畸過(guò)程中安全有效地加速牙齒移動(dòng)一直是廣大學(xué)者關(guān)注的課題。骨形成蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β 超家族成員［1］，研究［2］表明，其主要參與機(jī)體的成骨活動(dòng)。骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein－2，BMP－2)是該家族中研究最廣泛、誘導(dǎo)活性最強(qiáng)且惟一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠正畸牙齒移動(dòng)模型，觀察不同正畸力作用下牙周組織張力側(cè)BMP－2蛋白表達(dá)的變化，深入了解成骨細(xì)胞活化的時(shí)機(jī)和機(jī)制，為探討不同力值與牙周組織改建的關(guān)系奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 10 周齡的Wistar 大鼠60只(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，許可證號(hào):SCXK 魯20130001)，雄性，體重210～227 g，要求牙體、牙列完整，無(wú)齲齒及牙周病變。普通飼料分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠按不同力值分成4組:A組(0 g)、B組(30 g)、C組(50 g)、D組(80 g)，各15只。

1．2 材料及儀器 游標(biāo)卡尺(桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司)，彈簧測(cè)力計(jì)(杭州西湖生物材料有限公司)，鎳鈦螺旋拉簧(北京圣馬特科技有限公司)，正畸用0．020 mm 結(jié)扎鋼絲(杭州森風(fēng)齒科材料廠)，BMP－2 抗體、SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1．3 大鼠正畸牙齒移動(dòng)模型的建立 選擇大鼠左側(cè)第一磨牙為實(shí)驗(yàn)牙，切牙為支抗牙，用100 mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉并固定大鼠。采用0．020 mm 正畸結(jié)扎鋼絲從左上第一磨牙和第二磨牙的鄰間隙穿過(guò)，并連接于預(yù)備好的鎳鈦螺旋拉簧一端備用。用牙科高速渦輪機(jī)尖頭金剛砂車(chē)針在上頜中切牙和第一磨牙的牙頸部頰側(cè)面和近中軸面制備一淺凹，用正畸測(cè)力計(jì)分別調(diào)整正畸力為0、30、50、80 g，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量各力值拉伸的距離，另取一段結(jié)扎鋼絲連接于鎳鈦螺旋拉簧另一端并拉伸至實(shí)驗(yàn)所用的力值長(zhǎng)度，固定于中切牙的固位溝內(nèi)。以上頜2個(gè)中切牙為支抗向前移動(dòng)第一磨牙。最后用樹(shù)脂粘結(jié)劑覆蓋結(jié)扎鋼絲與固位溝處以加強(qiáng)固位。每日檢查動(dòng)物口腔并測(cè)量力值以保證力值恒定，發(fā)現(xiàn)鎳鈦螺旋拉簧脫落則重新加載。為補(bǔ)償螺旋拉簧應(yīng)力疲勞及牙移動(dòng)引起的力值衰減，每周加力1次。

1．4 牙齒移動(dòng)距離的測(cè)量 各組分別于安裝牙齒移動(dòng)裝置后第1、3、7、14、21天各處死3只大鼠，分離左側(cè)上頜骨，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只大鼠上頜左側(cè)第一磨牙遠(yuǎn)中舌溝點(diǎn)與第二磨牙近中舌溝點(diǎn)間的距離(整個(gè)測(cè)量的過(guò)程中忽略支抗的喪失)，由同一人進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果精確到0．01 mm，測(cè)量3次，取平均值。

1．5 牙周組織HE 染色觀察 處死大鼠，取上頜第一、二磨牙及周?chē)啦酃墙M織，多聚甲醛固定48 h。采用100 g/L EDTA(pH 7．4)于4℃條件下脫鈣4～6周，至用大頭針扎標(biāo)本的牙組織感覺(jué)無(wú)阻力為止。常規(guī)乙醇梯度脫水各24 h，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇與正丁醇混合液、正丁醇各處理12 h。二甲苯透明，梯度浸蠟，60～62℃石蠟包埋，制備牙齒上頜骨近遠(yuǎn)中方向縱切片，片厚5 μm，HE 染色，觀察牙周組織的變化情況。

1．6 牙周組織張力側(cè)BMP-2 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 牙周組織切片脫蠟至脫水化后，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2封閉10 min，1 g/L 胰蛋白酶室溫孵育10 min 滅活內(nèi)源性酶，PBS 沖洗3次，每次2 min;滴加50 μL BMP－2 抗體(按1∶50 稀釋)。4℃過(guò)夜，PBS(pH 7．2～7．6)洗滌3次，每次10 min，37℃復(fù)溫1 h，滴加50 μL DAKO 二抗復(fù)合物，37℃孵育30 min，PBS 洗3次，每次3 min，DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色5～10 min。蒸餾水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染，蒸餾水沖洗。常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。利用Biosens Digital Imaging System(上海山富科學(xué)儀器有限公司)高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)對(duì)BMP－2 進(jìn)行定量分析。在組織切片上確定測(cè)量部位:第一磨牙根中1/3 處張力側(cè)(遠(yuǎn)中)牙周膜的近牙骨質(zhì)側(cè)。每個(gè)部位選擇3個(gè)視野，測(cè)定積分光密度值，結(jié)果取平均值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，4組間大鼠牙齒移動(dòng)距離及牙周組織張力側(cè)BMP－2蛋白表達(dá)情況的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠牙齒移動(dòng)距離的比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

2．2 各組大鼠牙周組織HE 染色結(jié)果 A組各時(shí)間段牙周膜近遠(yuǎn)中間隙等寬，膠原纖維排列規(guī)則，破骨細(xì)胞少見(jiàn)。B組壓力側(cè)牙周膜變窄，牙槽骨邊緣可見(jiàn)少量的骨吸收陷窩和破骨細(xì)胞。C組牙周組織反應(yīng)活躍，牙周膠原纖維排列不規(guī)則，可見(jiàn)大量的骨吸收陷窩和破骨細(xì)胞;張力側(cè)牙周膜間隙增寬，血管擴(kuò)張，新生的成骨細(xì)胞沿牙槽骨側(cè)排列。D組壓力側(cè)牙周膜纖維排列混亂，有明顯的牙槽骨和牙骨質(zhì)的吸收，破骨細(xì)胞少見(jiàn);張力側(cè)牙周纖維斷裂，新生的成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞少見(jiàn)。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠牙齒移動(dòng)距離的比較(n=3) mm

圖1 正畸力施加第7天各組大鼠牙周組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)

2．3 各組大鼠牙周組織張力側(cè)BMP-2 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

圖2 正畸力施加第7天各組大鼠牙周組織張力側(cè)BMP-2 蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表2 各組大鼠牙周組織張力側(cè)BMP-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(n=3)

3 討論

正畸力是正畸牙齒移動(dòng)的關(guān)鍵因素。King等［3］觀察發(fā)現(xiàn)40～60 g 是正畸牙齒移動(dòng)的適當(dāng)力值范圍，可以觀察到特征性的牙齒移動(dòng)及相關(guān)骨改建的過(guò)程。燕濱漪等［4］觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠磨牙施加80～100 g 力時(shí)，壓力側(cè)出現(xiàn)廣泛的透明樣變，發(fā)生潛行性骨吸收。因此該實(shí)驗(yàn)選用小力值30 g、中力值50 g、大力值80 g 來(lái)研究大鼠牙周組織的變化情況。

在正畸過(guò)程中，牙齒移動(dòng)伴隨著牙槽骨的改建，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常以牙移動(dòng)速度來(lái)動(dòng)態(tài)反映骨改建的情況。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第1～7天時(shí)B組和C組牙齒移動(dòng)快，可能是因?yàn)檠例X移動(dòng)前期牽拉牙周膜使其出現(xiàn)張力側(cè)增寬，牙周膜存在彈性較大張力側(cè)纖維增殖、增粗，促使牙周組織改建活躍，牙齒移動(dòng)距離增大。第7～14天，各加力組牙齒移動(dòng)速度較慢;組織學(xué)觀察顯示:壓力側(cè)血管壓縮、血流受阻，牙周膜內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣變結(jié)構(gòu)，牙槽骨改建停滯。第14～21天B組和C組牙齒移動(dòng)距離增大，說(shuō)明進(jìn)入了進(jìn)行性牙齒移動(dòng)階段，C組移動(dòng)距離最大，可能牙周組織改建活躍，說(shuō)明其力值是牙槽骨改建的最適力值。而D組牙齒移動(dòng)基本停滯，可見(jiàn)牙周組織壓力側(cè)破骨細(xì)胞較少，壓力側(cè)根中部可見(jiàn)牙骨質(zhì)的吸收，牙槽骨表面出現(xiàn)不規(guī)則的破骨陷窩，以潛掘性吸收為主。可能是由于力值過(guò)大，牙槽骨改建受到抑制的緣故。以上說(shuō)明50 g 是利于大鼠牙齒移動(dòng)的最適力值，合適的正畸力促進(jìn)牙周組織改建，提高矯治效能。

BMP－2 是誘導(dǎo)活性最強(qiáng)的成骨細(xì)胞因子，參與BMP－Smad 信號(hào)傳導(dǎo)通路［5－6］，在體內(nèi)通過(guò)自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)骨、軟骨等相關(guān)結(jié)締組織的形成［7－8］。研究［9－10］顯示BMP－2 在張力側(cè)牙周組織牙周韌帶(PDL)中，尤其在PDL 新生牙骨質(zhì)和牙槽骨附近染色較強(qiáng)，證實(shí)其與牙槽骨的改建有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組張力側(cè)牙周組織BMP－2 染色較淺，可能是在未加力的狀態(tài)下，牙周組織以自分泌形式維持其穩(wěn)態(tài);B組BMP－2 表達(dá)相對(duì)較低，說(shuō)明其激活張力側(cè)牙周膜及牙槽骨中成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的能力低，牙槽骨改建不活躍;C組BMP－2 表達(dá)增高，說(shuō)明C組牙周組織改建活躍，促進(jìn)張力側(cè)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖和分化;D組與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能D組牙周組織破壞嚴(yán)重，牙槽骨改建延遲。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與機(jī)械閾值理論相一致。30 g 力時(shí)應(yīng)變量很小，骨代謝處于負(fù)平衡狀態(tài)，以骨吸收為主，成骨活動(dòng)不活躍，牙槽骨改建緩慢。50 g 力時(shí)，應(yīng)變量增加，骨代謝進(jìn)入正的平衡狀態(tài)，成骨活動(dòng)活躍，以骨沉積為主，牙槽骨改建較快。80 g 力時(shí)超過(guò)牙周膜改建的最適力值，牙周組織破壞嚴(yán)重，骨代謝又進(jìn)入負(fù)平衡狀態(tài)，成骨和破骨活動(dòng)均不活躍，牙槽骨改建停滯。了解合適的力值在正畸治療中的重要性，既利于牙槽骨改建又可以提高牙齒移動(dòng)的效能。

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