膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇灶組織中高遷移率族蛋白B1的表達(dá)*

王新軍，楊如意，周少龍，楊永輝，武躍輝，王 振，謝井偉，梁 博

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒童腦癱康復(fù)科 鄭州450052

△男，1965年7月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:腦腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:wangxj@zzu．edu．cn

目前，癲癇發(fā)病機(jī)制尚不明確。成人期癲癇最常見的病因?yàn)槟X腫瘤，大部分低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤伴癲癇發(fā)作［1］。膠質(zhì)瘤并致癇灶切除術(shù)是治療膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的常用方法，且療效顯著［2-3］。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1，HMGB1)作為一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白，幾乎存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)［4］。已有研究［5-6］證實(shí)HMGB1 及其受體TLR4 參與癲癇鼠模型的發(fā)病和復(fù)發(fā)，并且人類顳葉癲癇病例海馬中HMGB1 和TLR4 表達(dá)的組織病理學(xué)模式與癲癇鼠模型相似;HMGB1 及其受體TLR4、RAGE 通過參與免疫反應(yīng)促使癲癇的發(fā)生。作者對(duì)人腦膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇灶組織中HMGB1 的表達(dá)進(jìn)行了檢測，探討其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 選取鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2007年1月1日至2009年12月30日手術(shù)治療的82例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者手術(shù)切除的致癇灶組織、膠質(zhì)瘤組織、瘤周非致癇灶腦組織蠟塊標(biāo)本。82例患者年齡15～68歲，其中男60例，女22例;術(shù)前均有典型癲癇發(fā)作癥狀，腦電監(jiān)測可確認(rèn)癲癇;24例患者致癇灶位于額葉，40例位于顳葉，18例位于頂葉;術(shù)前癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間≤5 min 40例，＞5 min 42例;術(shù)前癲癇平均發(fā)作頻率≤3次/月24例，＞3次/月58例;21例為低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤，61例為高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤;所有患者術(shù)前均未接受放化療及其他治療。腫瘤組織均經(jīng)病理診斷為膠質(zhì)瘤。術(shù)中參考腦皮層和深部電極監(jiān)測結(jié)果取非功能區(qū)致癇灶組織標(biāo)本。瘤周非致癇灶腦組織為術(shù)中未引發(fā)異常腦電、且術(shù)后病理未見膠質(zhì)瘤細(xì)胞的非功能區(qū)腦組織。入選標(biāo)本及臨床信息均已獲患者、家屬及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1．2 主要試劑和儀器 兔抗人HMGB1 單克隆抗體購自美國Sigma 公司，羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司。

1．3 HMGB1 蛋白的檢測 標(biāo)本包埋后以3 μm 厚連續(xù)切片，置于防脫劑預(yù)處理后的載玻片上。滴加HMGB1 單克隆抗體(稀釋20 倍)4℃過夜，PBS 清洗后滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育20 min，PBS 清洗，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。以PBS 液代替一抗作陰性對(duì)照。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域，高倍視野下(×400)觀察5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)染色陽性細(xì)胞及視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評(píng)分:無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞百分比≤25%為1 分，≤50%為2 分，≤75%為3 分，＞75%為4 分;根據(jù)染色程度評(píng)分:無染色為0 分，淡黃色為1 分，深黃色為2 分。最后以兩種評(píng)分方式相加的綜合得分為最終得分，0 分為陰性，1～6 分為陽性;其中1～3 分為低表達(dá)，4～6 分為高表達(dá)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 17．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。致癇灶、膠質(zhì)瘤與瘤周非瘤腦組織中HMGB1表達(dá)的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，不同臨床病理因素患者致癇灶組織中HMGB1 表達(dá)的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各種腦組織中HMGB1 的表達(dá) HMGB1 在瘤周非致癇灶腦組織中有少量表達(dá)(圖1)，致癇灶組織、膠質(zhì)瘤組織中HMGB1 的表達(dá)明顯高于瘤周非致癇灶腦組織(表1、2)。

圖1 膠質(zhì)瘤、致癇灶、瘤周非致癇灶腦組織中HMGB1 的表達(dá)(SP，×400)

表1 致癇灶、瘤周非致癇灶腦組織中HMGB1 表達(dá)的比較例

表2 膠質(zhì)瘤、瘤周非致癇灶腦組織中HMGB1 表達(dá)的比較例

2．2 致癇灶組織中HMGB1 的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者致癇灶組織中HMGB1 表達(dá)與性別、年齡、致癇灶位置無關(guān)，而與癲癇持續(xù)時(shí)間、癲癇發(fā)作頻率、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別有關(guān)(表3)。

表3 致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系例(%)

3 討論

目前，對(duì)癲癇的發(fā)病機(jī)制研究較多，國內(nèi)外研究［5-6］提示HMGB1 在原發(fā)性癲癇的發(fā)病、復(fù)發(fā)中均起到重要作用，對(duì)于膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇，國內(nèi)外鮮見類似報(bào)道。膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇藥物治療效果欠佳，屬難治性癲癇。針對(duì)這類患者，鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科通常采用的方法為術(shù)中皮層腦電監(jiān)測準(zhǔn)確定位致癇灶，切除膠質(zhì)瘤的同時(shí)，盡可能地切除致癇灶，這樣才能使膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的手術(shù)效果得以保障［7-8］。這種手術(shù)治療的方法是該研究標(biāo)本獲取的前提。

該研究中，HMGB1 在膠質(zhì)瘤組織、致癇灶組織中的表達(dá)均高于瘤周非致癇灶腦組織，提示HMGB1 不僅參與了膠質(zhì)瘤的生長、浸潤［9］，對(duì)癲癇的發(fā)病也起到重要作用。膠質(zhì)瘤在生長、浸潤過程中HMGB1 高表達(dá)，影響瘤周組織的微環(huán)境，HMGB1 與其受體共同作用使皮層異常放電、信號(hào)傳遞紊亂，這可能是膠質(zhì)瘤繼發(fā)性癲癇的發(fā)病機(jī)制，HMGB1 及其作用機(jī)制可能成為膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇研究的新方向。

該研究發(fā)現(xiàn)，致癇灶組織中HMGB1 的表達(dá)與患者的性別、年齡、致癇灶位置無關(guān)，而與癲癇持續(xù)時(shí)間、發(fā)作頻率關(guān)系密切，該結(jié)果進(jìn)一步表明HMGB1 表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的發(fā)病有直接關(guān)系，換言之，膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇的發(fā)作可能隨致癇灶組織中HMGB1 表達(dá)的增高而劇烈。推測HMGB1在致癇灶中高表達(dá)將直接影響致癇灶異常放電的強(qiáng)度、頻率，致使癲癇發(fā)作頻繁、持續(xù)時(shí)間延長。接下來的研究中作者將會(huì)驗(yàn)證這種推測，若成立，則HMGB1 將可能成為藥物控制癲癇的新靶點(diǎn)。

研究［10］表明，膠質(zhì)瘤中HMGB1 表達(dá)與其病理級(jí)別關(guān)系密切。該研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇致癇灶組織中HMGB1 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別有關(guān)，這與Lynam 等［11］回顧性研究的癲癇發(fā)生率與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論基本吻合。膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇常由低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤引起，低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤中包含分化良好的細(xì)胞，其可釋放神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，這些傳導(dǎo)物質(zhì)可參與癲癇的發(fā)生;低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤生長時(shí)間長，其炎癥反應(yīng)亦可引發(fā)癲癇［12］。低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤更易引起癲癇發(fā)作，并且其致癇灶組織中HMGB1 高表達(dá)的可能原因有:①腫瘤性病變中神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的酶、蛋白質(zhì)表達(dá)及免疫反應(yīng)異常影響腦功能，引發(fā)癲癇。②腫瘤本身產(chǎn)生并刺激致癇灶產(chǎn)生大量HMGB1，HMGB1 與其受體(如TLR4［5］、RAGE［6］等)形成異常放電通路，形成癲癇發(fā)作的基礎(chǔ)。研究［13-14］表明，IL-1β 和HMGB1 參與炎癥反應(yīng)，降低癲癇發(fā)作的閾值，通過干預(yù)炎癥反應(yīng)徑路可減少癲癇發(fā)作頻率、降低發(fā)作程度和病理損害程度。上述研究結(jié)果均提示HMGB1 對(duì)癲癇的發(fā)生、發(fā)作有重要意義。

綜上所述，該研究揭示了致癇灶組織中HMGB1 表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇臨床病理因素之間的關(guān)系，對(duì)臨床治療、預(yù)后判斷均有一定意義，但膠質(zhì)瘤、致癇灶組織中HMGB1 促發(fā)癲癇的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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