無精癥患者睪丸組織中蛋白激酶C相互作用蛋白1的表達*

郝夢夢，王國賀，郭藝紅

鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心鄭州450052

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，通過卵胞漿內(nèi)單精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)能夠使生精功能輕度抑制的無精癥患者生育后代，但ICSI 技術(shù)存在的遺傳學風險不容忽視［1］。目前臨床上尚無有效治療睪丸內(nèi)無精子生成的方法，因此尋找生精障礙的分子生物學標志，具有非常重要的意義。蛋白激酶C 相互作用蛋白1(protein interacting with C kinase 1，PICK1)是一個從線蟲到人都高度保守的膜周蛋白，在多種組織中表達，其中在腦和睪丸中表達最高［2］。PICK1 蛋白參與體內(nèi)多種疾病的病理過程，如雄性不育癥、疼痛、腦卒中等，并參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及學習和記憶過程［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)PICK1 參與小鼠精子頂體的形成，PICK1 基因敲除雄性小鼠出現(xiàn)不育。作者對無精癥者睪丸組織中PICK1 蛋白的表達進行了檢測分析，探討PICK1表達強度與精子發(fā)生、ICSI 妊娠結(jié)局及男性生育力的關(guān)系。

1 對象與方法

1．1 研究對象 選擇2009年9月至2010年9月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖中心就診的無精癥患者50例，睪丸容積均≥12 mL;排除染色體核型異常，高泌乳素血癥，精索靜脈曲張，腮腺炎、結(jié)核、淋病等感染后遺癥等。無精癥診斷依據(jù)WHO 統(tǒng)一標準:3次精液離心沉淀后鏡檢，均未發(fā)現(xiàn)精子。根據(jù)病理分類及Johnson 評分法，生精功能基本正常(obstructive azoospermia，OA)15例(Johnson 評分8～10分)，生精功能低下(hypospermatogenesis，HS)9例(Johnson 評分6～7 分)，生精功能阻滯(spermatogenic arrest，MA)12例(Johnson 評分4～5 分)，唯支持細胞綜合征(sertolicellonly syndrome，SCOS)14例(Johnson 評分1～3 分)。

1．2 睪丸組織中PICK1 的檢測 研究對象行經(jīng)皮睪丸穿刺活檢術(shù)，標本進行HE 染色，顯微鏡下觀察睪丸組織曲細精管、界膜和間質(zhì)形態(tài)。選擇病理切片染色清晰、結(jié)構(gòu)完整的標本，對其相應的蠟塊行7 μm 厚切片，并固定于涂有APES 的專用載玻片上，采用免疫組化SP 法檢測PICK1 在睪丸組織中的表達，SP 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)服務有限公司。陽性染色表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒狀著色。使用HPIA-2000 圖文分析系統(tǒng)檢測陽性染色的積分光密度(IOD)值。

1．3 治療 應用ICSI 技術(shù)對OA組和HS組行助孕治療。采用常規(guī)黃體期長方案超排卵、卵巢穿刺取卵、體外受精和胚胎移植［5］。移植術(shù)后第14 和18天檢測血β-HCG，確定是否生化妊娠;術(shù)后第35天檢查腹部彩超，宮內(nèi)可見孕囊、胎芽及原始心管搏動者，確定為臨床妊娠。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13．0 分析，4組睪丸組織中PICK1 蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗;OA組和HS組年齡、不孕年限的比較應用兩獨立樣本t 檢驗，兩組正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 4組患者睪丸組織中PICK1 表達的比較 各級生精細胞中PICK1 多為強陽性表達，在胞漿或胞核中呈棕褐色著色;在間質(zhì)細胞及支持細胞中PICK1 呈弱陽性表達或陰性表達(圖1)。OA、HS、MA 和SCOS組PICK1 蛋白表達水平分別為(147．67 ±7．48)、(127．79±4．94)、(106．73 ±8．70)和(1．91 ±1．01)，差異有統(tǒng)計學意義(F=1 464．268，P＜0．001)，4組的表達水平依次降低(P＜0．05)。

圖1 睪丸組織中PICK1 免疫組化檢測結(jié)果(SP，×400)

2．2 OA 和HS組ICSI 結(jié)局的比較

2．2．1 一般情況 兩組男女雙方年齡、不孕年限比較，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

2．2．2 ICSI 結(jié)局 見表2。OA組正常受精率高于HS組;兩組卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 兩組一般情況的比較

表2 兩組ICSI 結(jié)局的比較

3 討論

男性不育病因復雜，主要原因是精子發(fā)生障礙，而精子發(fā)生障礙主要由遺傳缺陷包括基因突變和染色體異常引起［6］。Xiao 等［4］報道小鼠敲除PICK1基因后表現(xiàn)為精子頂體形成畸形，生精小管凋亡增加，且精子活力嚴重下降。該研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織中PICK1 弱表達的患者，其精子的受精能力低于強表達者，提示PICK1 的表達程度可能與睪丸組織內(nèi)精子的受精能力相關(guān)。

有研究［7］對圓頭精子癥患者PICK1 基因突變進行了篩查，發(fā)現(xiàn)PICK1 基因第13 外顯子出現(xiàn)G198A 純合錯義突變，基因突變患者表型與PICK1(－ / －)小鼠表型一致。然而Yatsenko 等［8］對381名畸精癥患者GOPC (Golgi-associated PDZ and coiled-coilmotif-containing protein)、PICK1 和ZPBP1(zona pellucida binding protein 1)基因的cDNA 進行了測序，發(fā)現(xiàn)ZPBP1 基因突變與精子頭部畸形相關(guān)，而未發(fā)現(xiàn)GOPC、PICK1 基因突變。在不育男性中GOPC、PICK1 基因可能極少發(fā)生突變，或許它們與精子成熟的相關(guān)性更大。該研究結(jié)果顯示，精母細胞和精子細胞高表達PICK1 蛋白，而間質(zhì)細胞及支持細胞低表達甚至不表達，且PICK1 表達強度與睪丸生精功能的強弱有關(guān)，推測PICK1 可能參與了精子形成的起始階段，并在精子成熟過程中起作用，PICK1 蛋白在睪丸組織中表達降低可能是男性生精功能障礙的原因之一。

PICK1 蛋白能與40 多種蛋白相互作用，它包含一個PDZ 結(jié)構(gòu)域和一個BAR 結(jié)構(gòu)域，PDZ 結(jié)構(gòu)域能和許多膜蛋白結(jié)合，極有可能成為藥物的靶點［9］。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使PICK1 在小鼠睪丸組織中特異性表達可以改善PICK1 敲除小鼠的精子生成異常和不育［10］。因此，PICK1 有可能成為男性不育的新的治療靶點，若能通過藥物促進PICK1 在睪丸組織內(nèi)表達，可為男性不育患者的治療提供幫助。由于該研究樣本量較少，同時，男性生精功能受多因素影響，因此PICK1 與男性不育的關(guān)系仍需要進一步研究、論證。

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［3］段賢春，汪永忠，高家榮，等．PICK1 蛋白生理功能及其作為藥物新靶點研究進展［J］．中國藥理學通報，2013，29(11):1606

［4］Xiao N，Kam C，Shen C，et al．PICK1 deficiency causes male infertility in mice by disrupting acrosome formation［J］．J Clin Invest，2009，119(4):802

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［8］Yatsenko AN，O＇Neil DS，Roy A，et al．Association of mutations in the zona pellucida binding protein 1 (ZPBP1)gene with abnormal sperm head morphology in infertile men［J］．Mol Hum Reprod，2012，18(1):14

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［10］Li X，Mao Z，Wu M，et al．Rescuing infertility of Pick1 knockout mice by generating testis-specific transgenic mice via testicular infection［J］．Sci Rep，2013，3:2842