氟暴露兒童ERα基因甲基化水平與氟斑牙及血清鈣水平的關系*

王科妍，崔蕊蕊，丁 中，崔留欣，趙明旭，程學敏，巴月#

1)鄭州大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室 鄭州450001 2)山東萬杰醫(yī)學院山東省高校生物醫(yī)學工程技術實驗室 淄博255213 3)開封市疾病預防控制中心地方病科 開封475000

氟斑牙作為地方性氟中毒的特征性表現(xiàn)之一，對兒童危害深遠。以往研究［1-3］顯示氟斑牙的發(fā)生除了與個體氟暴露的劑量、年齡、時間、營養(yǎng)因素等有關外，還存在個體易感性。雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)基因多態(tài)性與兒童氟斑牙有關;DNA 甲基化作為表觀遺傳特性之一目前受到廣泛關注，研究［4-6］發(fā)現(xiàn)ERα 基因甲基化與乳癌、骨質(zhì)疏松等疾病有關。但氟暴露是否引起ERα 基因甲基化改變，以及ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平與兒童氟斑牙患病程度是否有關，目前尚未見報道。該研究通過測定氟病區(qū)兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平，分析兒童氟斑牙及血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的關系，旨在從表觀遺傳學角度探討兒童氟斑牙的發(fā)病機制。

1 對象與方法

1．1 調(diào)查點的選擇 在精確檢測水氟含量的基礎上，從河南省某縣飲水型地方性氟中毒流行地區(qū)選擇飲水氟質(zhì)量濃度超過1．0 mg/L 的2 所小學作為調(diào)查點。2 所學校所在地區(qū)經(jīng)濟水平、人口分布、自然條件、農(nóng)作物種類、飲食習慣、人口構(gòu)成基本相同。同時測定環(huán)境介質(zhì)(水、空氣、土壤、農(nóng)作物等)中鈣水平，排除其他元素干擾。

1．2 調(diào)查對象的選擇 整群抽取所選調(diào)查點8～12歲且自出生一直居住在當?shù)氐膬和?排除臨床上患有影響鈣磷代謝疾病和近期接受鈣劑、氟化物、激素治療的兒童)作為調(diào)查對象，共有174 名兒童入選。對符合調(diào)查要求的兒童分別進行問卷調(diào)查、氟斑牙檢查、體格檢查，并采集生物樣本。研究經(jīng)家長簽署知情同意書，遵循兒童意愿，并經(jīng)鄭州大學倫理委員會批準。

1．3 生物樣本的采集及處理 采集所有調(diào)查兒童空腹外周靜脈血10 mL(非抗凝和EDTA 抗凝各5 mL)及晨尿100 mL。非抗凝血離心分離血清，并與抗凝血和尿液一起置于－80℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 兒童氟斑牙的判定 兒童氟斑牙檢查及結(jié)果判定由地方性氟中毒防治公共衛(wèi)生執(zhí)業(yè)醫(yī)師按照Dean 分級法［7］進行。將分級為0(正常)和1(可疑)的調(diào)查對象定義為正常組，2(極輕)和3(輕度)定義為輕度組，4(中度)和5(重度)定義為中重度組。174例兒童中，正常組85 人，輕度組53 人，中重度組36 人。

1．5 生物樣本檢測分析

1．5．1 兒童尿氟水平的測定 采用氟離子選擇電極(PF-1 型，上海電元器件廠)法測定調(diào)查對象尿氟水平。標準曲線的線性范圍為0．1～10．0 mg/L，r均＞0．999［8］。以尿氟質(zhì)量濃度超過1．5 mg/L 判斷為高氟負荷狀態(tài)。

1．5．2 兒童血清鈣水平的測定 將強酸(濃鹽酸與高氯酸體積比為1∶4 的混合酸)與血清按體積比1∶100 混合、消化后，采用原子吸收分光光度計(Z-5000 型，日立，日本)以標準曲線法(r ＞0．999)進行檢測，所有樣品均測定2個平行樣。

1．5．3 ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率檢測 應用UCSC/Ensembl(http://genome．ucsc．edu/)查 找 基因啟動子序列，采用甲基化引物設計軟件Methyl Primer Express v1．0 設計引物序列(表1)?；蚪MDNA 提取采用血液基因組柱式小量提取試劑盒(北京康為世紀);采用EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒(Zymo Research，美國)對提取的基因組DNA 進行處理。

表1 ERα 基因啟動子區(qū)甲基化引物序列及產(chǎn)物大小

ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率檢測采用real-time PCR 方法。20 μL 反應體系中包括2 ×Ultra SYBR Green PCR Mix(北京康為世紀)10 μL，上、下游引物各160 nmol/L，300 ng DNA，6．5 μL ddH2O。PCR 反應條件:95℃10 min;94℃15 s，54℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。以純水作為陰性對照對實驗進行質(zhì)量控制。參考文獻［9］方法計算DNA 甲基化率。1．6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)的錄入采用EpiData 2．0，雙人雙機獨立錄入，分析采用SPSS 12．0。ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，將其對數(shù)轉(zhuǎn)化后符合正態(tài)分布。3組間患兒年齡、尿氟、血清鈣水平及對數(shù)轉(zhuǎn)化后的ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的比較采用單因素方差分析及SNK-q 檢驗，性別構(gòu)成的比較采用χ2檢驗。以ERα 基因甲基化率為因變量，尿氟、血清鈣水平、年齡、性別(賦值:男性=1，女性=2)為自變量做多重線性回歸進行影響因素篩選，對主要影響因素血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率進行相關分析。檢驗水準α =0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同組別兒童基本變量的分析 結(jié)果見表2。調(diào)查地區(qū)兒童氟斑牙患病率為51．15%。由表2 可知，不同氟斑牙分度的兒童年齡差異無統(tǒng)計學意義，性別構(gòu)成差異有統(tǒng)計學意義。中重度組兒童尿氟水平高于正常組和輕度組。輕度組兒童血清鈣水平低于正常組。

表2 3組兒童基本變量的比較

2．2 不同組別兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率比較 結(jié)果見表3。由表3 可知，不同組別兒童甲基化率差異無統(tǒng)計學意義。3組男性兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率差異有統(tǒng)計學意義，且中重度組兒童高于正常組兒童。3組女性兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率差異無統(tǒng)計學意義。

表3 3組ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率比較 %

2．3 ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率與血清鈣水平的相關分析 結(jié)果顯示:血清鈣為ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的影響因素(t =2．281，P =0．024)。對ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率與血清鈣水平進行相關分析，結(jié)果為:r= －0．172，P=0．024。

3 討論

3．1 血清鈣水平與兒童氟斑牙 該研究發(fā)現(xiàn)氟病區(qū)輕度氟斑牙患兒血清鈣水平較非患兒降低，但中重度組與正常組兒童比較，差異無統(tǒng)計學意義，與史曉紅等［10］的研究結(jié)果一致。高氟與腸道和血液中的鈣離子結(jié)合形成氟化物，影響鈣的吸收和沉積，進而引起血鈣暫時性降低可能是其主要原因。高氟和低鈣共同作用使甲狀旁腺激素分泌增多，促進破骨細胞骨轉(zhuǎn)換作用加快，是血鈣在氟斑牙患病后期又趨于正常的原因。有研究［11］發(fā)現(xiàn):用氟化鈉喂飼的小鼠60 d 內(nèi)血清鈣離子水平較正常飼養(yǎng)的小鼠低，而60 d 后血清鈣水平又上升。李廣生等［12］提出的地方性氟中毒屬于“鈣矛盾疾病”的觀點指出:細胞內(nèi)鈣離子的增多可能是低鈣加重氟中毒的重要機制，低水平氟對鈣泵的作用是正性作用，而隨著氟水平的升高，鈣泵的活性明顯下降，反映出一種非線性的或前后矛盾的“全劑量-效應”鈣曲線趨勢，又稱U型劑量反應，也是鈣水平恢復的原因之一。

3．2 血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的關系 該研究發(fā)現(xiàn)，血清鈣水平與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率呈負相關，即隨著ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的升高，血清鈣水平有下降趨勢。關于血清鈣與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平的關系，以往研究比較少。有研究［5］發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏可導致骨質(zhì)疏松，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平在絕經(jīng)后婦女顯著高于絕經(jīng)前的婦女。產(chǎn)生這種關系的可能原因是，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化使ERα 基因表達降低或者沉默，引起雌激素抵抗［13］，使雌激素對腸道鈣離子的吸收及腎小管對鈣離子重吸收的促進作用減弱，且對鈣離子的排泄作用增強［14-15］，從而引起血清鈣水平下降。

3．3 兒童氟斑牙與ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率的關系 該研究發(fā)現(xiàn)，隨著氟斑牙患病程度的加重，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，且這種變化具有性別差異，表現(xiàn)為中重度組男性兒童ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率高于正常組和輕度組兒童。目前尚缺乏ERα 基因甲基化與氟斑牙關系的研究，但有研究［16］表明雌激素對骨骼發(fā)育的影響十分明顯，特別是對刺激成骨細胞活動、促進鈣磷的骨內(nèi)沉積具有重要作用。牙齒的形成與骨骼有相似之處，氟斑牙的某些病理改變也與氟骨癥相似。以往研究［17-18］發(fā)現(xiàn)，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化水平與其轉(zhuǎn)錄活性呈負相關，甲基化水平升高導致ERα 表達下調(diào)或沉默，進而影響雌激素的作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，ERα 基因啟動子區(qū)甲基化率與血清鈣離子水平呈負相關，提示ERα 基因甲基化可能影響機體鈣代謝，從而參與氟斑牙的形成。由于該研究為氟斑牙與表觀遺傳改變的探索性研究，涉及樣本含量較小，因此，需要進一步擴大研究范圍，增加樣本含量以驗證研究結(jié)果，為氟中毒發(fā)生的表觀遺傳機制研究提供新的思路。

致謝:感謝參與課題現(xiàn)場調(diào)查工作的鄭州大學公共衛(wèi)生學院、開封市疾病預防控制中心及通許縣疾病預防控制中心地方病科的工作人員;感謝所有參與此項研究的調(diào)查對象。

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