臭氧急性暴露對豚鼠肺組織中NO水平的影響*

段麗菊，隋美麗，趙凝秋，李思晨，王如群，胡 婕，陳彬翰

1)鄭州大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室 鄭州450001 2)鄭州大學公共衛(wèi)生學院流行病學教研室 鄭州450001

△女，1981年11月生，博士研究生，講師，研究方向:環(huán)境毒理學，E－mail:dlj@zzu．edu．cn

近年來，隨著經濟的快速發(fā)展，空氣污染物數量急劇增加。汽車尾氣中的氮氧化物和揮發(fā)性有機物在紫外線的照射下發(fā)生光化學反應，產生大量的臭氧，導致大氣中臭氧污染極為嚴重。目前，我國很多大中城市如北京、上海、青島、鄭州等均存在大氣臭氧含量超標的現(xiàn)象［1－4］。臭氧具有強氧化性，能強烈刺激呼吸道，造成咽喉腫痛、胸悶咳嗽，引發(fā)支氣管炎和肺氣腫。吸入臭氧會導致肺部上皮層的蛋白質和酯類物質發(fā)生氧化作用，生成氧化蛋白和自由基，損傷上皮組織，導致肺部巨噬細胞數量增多并產生細胞毒素、炎癥介質［5－6］。臭氧的強氧化性導致肺組織產生的活性氧和活性氮等會繼續(xù)對組織造成傷害，嚴重危害人體的健康［7］。一氧化氮(nitric oxide，NO)在許多病理反應中具有介導炎癥細胞凋亡、調節(jié)炎癥反應方向的功能，是一種很活躍的自由基。在炎癥反應過程中，NO 可由多種相關細胞產生，如巨噬細胞、中性粒細胞、NK 細胞等。適量的NO 對機體具有保護作用，但過量的NO 具有細胞毒性作用，可損傷肺泡上皮細胞表面磷脂及蛋白，抑制肺泡表面活性物質的生成，促進肺組織的炎性滲出及肺泡的損傷［8］。作者采用體積分數為0．000 1%的臭氧對豚鼠染毒3 h，測定豚鼠肺組織中NO 含量及一氧化氮合酶(NOS)活力，從而研究臭氧暴露對機體肺組織NO 含量的影響，以進一步探討臭氧所致呼吸道炎癥反應可能的機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 20只3個月齡Dunkin Hartley 豚鼠，普通級，雌雄各半，體重280～350 g，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司，合格證號為SCXK(京)2010－0001。飼養(yǎng)于20～25℃、相對濕度為40%～70%的環(huán)境中。每天供給自來水、豚鼠飼料及新鮮蔬菜，動物飲食自由。

1．2 儀器及試劑 HOPE－MED 8050 動態(tài)染毒系統(tǒng)(天津開發(fā)區(qū)合普工貿有限公司)，HH－42 數顯恒溫攪拌循環(huán)水箱(常州國華電器有限公司)，H1650－W離心機(湖南象儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，XH－C混合器(常州朗越儀器制造有限公司)，V－5800PC型可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)，Z－1200 型臭氧檢測儀(美國ESC 公司)，CH－KTB2G 臭氧發(fā)生儀(廣州創(chuàng)環(huán)臭氧電器設備有限公司)，玻璃勻漿器和恒溫箱。NO 測定試劑盒、NOS 測定試劑盒、BCA 法蛋白定量測試盒均購自南京建成生物工程研究所，戊巴比妥鈉鹽購自德國Merck 公司。

1．3 分組與染毒 雌、雄豚鼠均隨機分為陰性對照組、臭氧暴露組，每組各10只。暴露前，采用臭氧發(fā)生儀，通過調節(jié)參數，使之能夠穩(wěn)定地輸出染毒所需濃度的臭氧。將臭氧測定儀置于染毒柜中，監(jiān)測臭氧濃度。待臭氧濃度穩(wěn)定在體積分數為0．000 1%左右10 min 時將臭氧暴露組豚鼠置于染毒柜中暴露3 h(國際上公認的臭氧急性染毒模型濃度);暴露期間，每5 min 記錄一次臭氧濃度。陰性對照組置于通入過濾空氣的染毒柜中，臭氧濃度為0，暴露3 h。

1．4 肺組織中NO 含量及NOS 活力的測定 豚鼠于當日上午8:00 開始連續(xù)染毒3 h，次日上午8:00麻醉處死，取肺組織迅速置于冰上制成勻漿，3 000 r/min 離心10 min。取組織勻漿上清液，按各試劑盒操作說明書進行NO 含量、NOS 活力測定。

1．5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21．0 進行分析。分別應用兩獨立樣本t 檢驗和秩和檢驗分析兩組大鼠肺組織中NO 含量和NOS 活力［應用M(P25，P75)進行描述］的差異，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 臭氧染毒濃度的測定結果 臭氧急性暴露3 h過程中，豚鼠實際暴露劑量為0．000 101% ±0．000 005%，與設定的體積分數為0．000 1%非常吻合，變異系數僅為4．95%，說明用動態(tài)染毒系統(tǒng)和臭氧發(fā)生儀建立的動態(tài)臭氧染毒系統(tǒng)是可靠的。

2．2 豚鼠肺組織中NO 含量和NOS 活力測定結果見表1。1 ppm 臭氧急性暴露3 h 可使豚鼠肺組織中NO 含量升高，但對肺組織NOS 活力無影響。

表1 豚鼠肺組織中NO 含量和NOS 活力測定結果

3 討論

臭氧作為光化學煙霧的產物之一，是一種普遍存在的城市空氣污染物。以往關于臭氧急性暴露的研究中，大多采用體積分數為0．000 1%臭氧連續(xù)暴露3 h 的急性暴露模型［9］。相關研究［9－11］表明，臭氧急性暴露可導致肺部發(fā)生氧化應激，導致炎癥反應的發(fā)生，引起氣道高反應性，降低肺功能。

作者的研究結果表明，體積分數為0．000 1%臭氧暴露3 h 可導致豚鼠肺組織中NO 含量升高，說明臭氧暴露可導致肺組織發(fā)生炎癥反應，該研究結果與張景明等［12］的研究結果一致。Modig 等［13］隨機選取瑞士5 841 位25～75歲成年人進行研究，通過測定其呼出氣中NO 含量，發(fā)現(xiàn)人群短期臭氧暴露可導致呼出氣中NO 含量增加。Khan 等［14］在研究人體內源性異戊二烯在炎癥反應時的生理功能時發(fā)現(xiàn)呼出氣中NO 含量與所暴露臭氧濃度呈正相關。但Barath 等［15］通過將健康志愿者分別暴露于顆粒物濃度為300 μg/m3的汽車柴油尾氣及過濾空氣中1 h 和體積分數為0．000 03%臭氧及過濾空氣中75 min 進行研究，發(fā)現(xiàn)呼出氣中NO 含量增高與臭氧無關，而是與柴油尾氣相關，提示兩者所致的呼吸道炎癥反應機制不同，而臭氧所致的急性呼吸道炎癥反應不能用呼出氣中NO 含量來檢測，該研究與以往研究［16－17］結果一致。

肺組織中NO 含量增高的原因可能是NO 合成增加，或代謝減少。機體內NO 合成主要有兩種途徑:①通過NOS 介導合成。②通過亞硝酸鹽還原產生。而體內NO 代謝主要有3種途徑:①在有氧條件下，被快速氧化。②與各種分子相互反應，如NO與超氧陰離子反應產生具有很強細胞毒性的過氧亞硝基。③NO 及其衍生物修飾蛋白質半胱氨酸自由巰基，生成亞硝基巰醇。作者的研究結果顯示，體積分數為0．000 1%臭氧急性暴露對豚鼠肺組織中NOS 活力無影響，表明臭氧暴露組NO 含量升高并非通過機體內NOS 介導合成增加所致，很可能是臭氧暴露導致機體內亞硝酸鹽還原增加或NO 代謝途徑受阻所致。具體原因有待更深層次的研究。

NO 作為一種可調節(jié)細胞功能的信息分子，具有介導炎癥反應的功能，可作為臭氧所致氣道炎癥反應中的一種介質。同時，NO 也是某些急性肺損傷的損傷因子，可與超氧自由基結合生成過氧亞硝酸鹽，導致氣道炎癥和氣道上皮損傷，發(fā)揮其毒性作用［8］。臭氧所致炎癥反應過程中會產生自由基及活性氧、活性氮，而這些物質本身即可對肺組織造成傷害。這表明，臭氧急性暴露在導致豚鼠肺部發(fā)生炎癥反應的同時，肺組織中升高的NO 會加重臭氧導致的炎癥反應，加大其對肺組織的傷害。

總之，臭氧急性暴露可使豚鼠肺組織中NO 含量升高，但并不影響體內NOS 活力。進一步探討臭氧急性暴露導致肺組織中NO 含量升高的原因，將有利于研究臭氧所致的肺部炎癥損傷的機制，并為臭氧所致呼吸系統(tǒng)損傷的預防與治療提供依據。

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