N-甲基環(huán)丙沙星酰腙的合成及抗腫瘤活性*

尚慧杰，高留州，謝玉鎖，閆 強，吳書敏，倪禮禮，黃文龍，謝松強，胡國強#

1)鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系 鄭州450064 2)河南大學(xué)化學(xué)生物學(xué)研究所 開封475001 3)中國藥科大學(xué)新藥研究中心南京210009

基于拓撲異構(gòu)酶不但是抗腫瘤藥物的重要作用靶酶［1］，也是抗菌氟喹諾酮羧酸的作用靶酶，且兩種拓撲異構(gòu)酶在功能和序列上具有相似性［2］，因此，通過結(jié)構(gòu)修飾可轉(zhuǎn)化抗菌氟喹諾酮羧酸的抗菌活性到抗腫瘤活性［3］。但是，目前對氟喹諾酮的結(jié)構(gòu)修飾多集中于喹啉環(huán)C-7 雜環(huán)取代基的變化，所產(chǎn)生的候選物因機體內(nèi)毒性或穩(wěn)定性或生物利用度等生物學(xué)問題而未能進入臨床評價［4］。因此，通過新的結(jié)構(gòu)修飾途徑降低氟喹諾酮的毒性、增加其穩(wěn)定性、提高其生物利用度是促進其抗腫瘤候選化合物向成藥性發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究［5］發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮C-3 位羧基雖是抗菌活性所必需的藥效團，但并非為抗腫瘤活性所必要，可被其生物電子等排體稠雜環(huán)替代，但這樣將導(dǎo)致化合物的剛性較強、相對分子質(zhì)量過大，不利于成藥性的發(fā)展［6］。酰腙化合物因具有N，O 供電子原子，易與大分子靶標形成氫鍵而增加其親合力，從而提高其抗腫瘤活性;另一方面，酰腙中的亞胺N=C 雙鍵也較活潑，易與靶標大分子中的親核基團如氨基(NH2)和巰基(SH)進行加成，進一步提高其細胞毒性［7］。鑒于上述研究成果，作者選擇重要的藥效團酰腙作為抗菌氟喹諾酮N-甲基環(huán)丙沙星C-3 羧基的生物電子等排體，設(shè)計合成了新的目標化合物N-甲基環(huán)丙沙星酰腙，并進行了體外抗腫瘤活性評價，以期發(fā)現(xiàn)抗腫瘤氟喹諾酮苗頭化合物，為進一步優(yōu)化提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 合成路線 目標化合物4a～4l 的制備見線路圖1。環(huán)丙沙星(化合物1)經(jīng)甲基化反應(yīng)得到N-甲基環(huán)丙沙星(化合物2)［8］，然后發(fā)生肼解反應(yīng)得到N-甲基環(huán)丙沙星酰肼(化合物3)。酰肼與苯甲醛或取代的苯甲醛通過縮合反應(yīng)得到N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4a～4l)。

圖1 目標化合物4a～4l 的制備路線圖

1．2 主要材料與儀器 環(huán)丙沙星(化合物1)為商業(yè)品，N-甲基環(huán)丙沙星由(化合物2)由化合物1 通過Eschweiler-Clarke 甲基化反應(yīng)制備，其余試劑為分析純。實驗用癌細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫。WK-1B 數(shù)字熔點儀(上海精密科學(xué)儀器廠);Bruker AM-400 型核磁共振儀(德瑞士Bruker 公司)，DMSO-d6 為溶劑，TMS 為內(nèi)標;Esquire LC 型質(zhì)譜儀(德國Bruker 公司);PE2400-Ⅱ型元素分析儀(美國PE 公司);BIO-RAD-680 型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1．3 化學(xué)合成 將化合物2(72．5 g，0．21 mol)和80%水合肼(105 g，2．1 mol)的混合物加熱攪拌回流反應(yīng)8 h;冷卻至室溫，濾集固體，用無水乙醇重結(jié)晶，得黃色結(jié)晶(化合物3)。取1．0 g (2．8 mmol)化合物3 溶于15 mL 無水乙醇中，加入等物質(zhì)的量的苯甲醛或取代苯甲醛，回流10 h;放置室溫，過濾析出的固體，乙醇洗滌。用無水乙醇或DMF-乙醇重結(jié)晶，得黃色固體目標化合物4a～4l。

1．4 抗腫瘤活性實驗 取目標化合物4a～4l、對照蒽醌類抗腫瘤藥阿霉素(DOX)及母體環(huán)丙沙星用DMSO 配成1．0 ×10－2mol/L 的儲備液，用RPMI 1640 稀釋到所需濃度(0．1、1．0、10．0、50．0、100．0 μmol/L)，制備供試液。①取對數(shù)生長期的人肝癌細胞(SMMC-7721)，以每孔5 000個細胞接種于96孔板。隔夜培養(yǎng)后，加入供試液。48 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 g/L MTT 溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，輕輕振蕩30 min，用酶標儀在570 nm 波長處測OD 值。②取對數(shù)生長期的小鼠白血病細胞(L1210)和人白血病細胞(HL60)，以每孔7 000個細胞接種于96 孔板，隨后加入供試液。48 h 后每孔加入5 g/L MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入10 g/L SDS 溶液100μL 培養(yǎng)過夜，用酶標儀在570 nm 波長處測OD 值。細胞生長抑制率=(1 －實驗組OD/對照組OD)×100%。以藥物濃度對數(shù)值對抑制率作線性回歸，得劑量-效應(yīng)方程，依此計算出供試化合物對癌細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。所有實驗在相同條件下重復(fù)進行3次。

2 結(jié)果

2．1 化合物的結(jié)構(gòu)表征 N-甲基環(huán)丙沙星酰肼(化合物3):收率70%;mp 222～224℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．16 (s，1H，CONH)，8．75 (s，1H，2-H)，7．82 (d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．56 (d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，4．57(s，2H，NH2)，3．75～3．67(m，1H，1＇-H)，3．56 (t，J =6．2 Hz，4H，2 ×2＇-H)，2．67(t，J =6．2 Hz，4H，2 ×3＇＇-H)，2．24 (s，3H，CH3)，1．25～1．12(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):360 ［M + H］+;Anal．calcd．for C18H22FN5O2:C 60．15%，H 6．17%，N 19．49%;Found:C 60．36%，H 6．38%，N 19．74%。

苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4a):收率86%;mp 243～245℃;1H NMR (DMSO-d6)δ:13．13(s，1H，CONH)，8．73(s，1H，2-H)，8．44(s，1H，N=CH)，7．92(d，J=13．2 Hz，1H，5-H)，7．78～7．46(m，6H，8-H 和Ph-H)，3．81～3．78(m，1H，1＇-H)，3．28(t，J=6．2 Hz，4H，2 ×2＇-H)，2．65(t，J =6．2 Hz，4H，2×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．27～1．16(m，4H，2×2＇-H);EI-MS(m/z):448［M+H］+;Anal．calcd．for C25H26FN5O2:C 67．10%，H 5．86%，N 15．65%;Found:C 67．34%，H 5．56%，N 15．87%。

水楊醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4b):收率82%;mp 218～220℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．18(s，1H，CONH)，11．32(s，1H，OH)，8．73(s，1H，2-H)，8．32(s，1H，N = CH)，7．86(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．53(d，J=7．2 Hz，1H，8-H)，7．36～6．68(m，4H，Ph-H)，3．82～3．80(m，1H，1＇-H)，3．35～3．28(m，4H，2 ×2＇-H)，2．57(br，4H，2 ×3＇-H)，2．25(s，3H，CH3)，1．23～1．17(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):464 ［M + H］+;Anal．calcd．for C25H26FN5O3:C 64．78%，H 5．65%，N 15．11%;Found:C 65．02%，H 5．37%，N 15．34%。

小茴香醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4c):收率72%;mp 152～154℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．17(s，1H，CONH)，8．67(s，1H，2-H)，8．28(s，1H，N = CH)，7．87(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．56(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．38～6．72(m，4H，Ph-H)，3．87(s，3H，OCH3)，3．82～3．76(m，1H，1＇-H)，3．34～3．25(m，4H，2 ×2＇-H)，2．58(br，4H，2 ×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．24～1．26(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):478 ［M + H］+;Anal．calcd．for C26H28FN5O3:C 65．40%，H 5．91%，N 14．67%;Found:C 65．62%，H 5．78%，N 14．83%。

大茴香醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4d):收率86%;mp 166～168℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．15(s，1H，CONH)，8．68(s，1H，2-H)，8．26(s，1H，N = CH)，7．84(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．57(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．43～6．68(m，4H，Ph-H)，3．88(s，3H，OCH3)，3．83～3．75(m，1H，1＇-H)，3．32～3．24(m，4H，2 ×2＇-H)，2．63(br，4H，2 ×3＇-H)，2．25(s，3H，CH3)，1．27～1．22(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):478 ［M + H］+;Anal．calcd．for C26H28FN5O3:C 65．40%，H 5．91%，N 14．67%;Found:C 65．66%，H 5．74%，N 14．85%。

胡椒醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4e):收率93%;mp 251～253℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．14(s，1H，CONH)，8．69(s，1H，2-H)，8．35(s，1H，N = CH)，7．86(d，J = 13．2 Hz，1H，5-H)，7．53～7．02(m，4H，8-H and Ph-H)，6．12(s，2H，OCH2O)，3．81～3．77(m，1H，1＇-H)，3．36～3．28(m，4H，2 ×2＇-H)，2．57～2．52(m，4H，2 ×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．27～1．20(m，4H，2 ×2＇-H);EIMS(m/z):492 ［M + H］+;Anal．calcd．for C26H26FN5O4:C 63．53%，H 5．33%，N 14．25%;Found:C 63．70%，H 5．09%，N 14．51%。

香草醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4f):收率87%;mp 219～221℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．21(s，1H，CONH)，10．87(s，1H，OH)，8．87(s，1H，2-H)，8．28(s，1H，N = CH)，8．04(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．60～6．85(m，4H，8-H and Ph-H)，3．87(s，3H，CH3O)，3．83～3．80(m，1H，1＇-H)，3．35～3．26(m，4H，2 ×2＇-H)，2．58～2．53(m，4H，2 ×3＇-H)，2．28(s，3H，CH3)，1．26～1．20(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):494［M +H］+;Anal．calcd．for C26H28FN5O4:C 63．28%，H 5．72%，N 14．19%;Found:C 63．56%，H 5．57%，N 14．38%。

3，4，5-三甲氧苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4 g):收率75%;mp 179～181℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．15(s，1H，CONH)，8．82(s，1H，2-H)，8．37(s，1H，N=CH)，7．96(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．82(d，J=7．2 Hz，1H，8-H)，7．46(s，2H，Ph-H)，3．86，3．88(2s，9H，3 ×CH3O)，3．81～3．76(m，1H，1＇-H)，3．34～3．18(m，4H，2 ×2＇＇-H)，2．56～2．53(m，4H，2 ×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．18～1．24(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):538 ［M +H］+;Anal．calcd．for C28H32FN5O5:C 62．56%，H 6．00%，N 13．03%;Found:C 62．74%)，H 5．87%，N 13．26%。

4-氟-苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4h);收率86%;mp 213～215℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．17(s，1H，CONH)，8．86(s，1H，2-H)，8．38(s，1H，N = CH)，8．03(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．96(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．83(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．68(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．80～3．78(m，1H，1＇-H)，3．38～3．22(m，4H，2 ×2＇-H)，2．67～2．58(m，4H，2 ×3＇-H)，2．30(s，3H，CH3)，1．23～1．25(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):466［M+ H］+;Anal．calcd．for C25H25F2N5O2:C 64．51%，H 5．41%，N 15．04%;Found:C 64．68%，H 5．28%，N 15．24%。

4-氯-苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4i):收率74%;mp 157～159℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．13(s，1H，CONH)，8．82(s，1H，2-H)，8．35(s，1H，N = CH)，8．02(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．87(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．81(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．66(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．76～3．72(m，1H，1＇-H)，3．36～3．20(m，4H，2 ×2＇-H)，2．63～2．56(m，4H，2 ×3＇-H)，2．28(s，3H，CH3)，1．21～1．24(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):482［M+ H］+;Anal．calcd．for C25H25ClFN5O2:C 62．30%，H 5．23%，N 14．53%;Found:C 62．48%，H 5．46%，N 14．71%。

4-硝基-苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4j):收率92%，mp ＞260℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．21(s，1H，CONH)，8．86(s，1H，2-H)，8．47(s，1H，N =CH)，8．12(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，8．04(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．86(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．73(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．78～3．81(m，1H，1＇-H)，3．37～3．25(m，4H，2 × 2＇＇-H)，2．66～2．63(m，4H，2 ×3＇-H)，2．31(s，3H，CH3)，1．23～1．25(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):493［M+H］+;Anal．calcd．for C25H25FN6O4:C60．97%，H 5．12%，N 17．06%;Found:C 61．13%，H 5．35%，N 17．24%。

4-羧基-苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4k):收率85%;mp 252～254℃;1H NMR(DMSOd6)δ:15．47 (brs，1H，COOH)，13．25 (s，1H，CONH)，8．94(s，1H，2-H)，8．56(s，1H，N = CH)，8．18(d，J=13．2 Hz，1H，5-H)，8．07(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．88(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．75(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．86～3．79(m，1H，1＇-H)，3．38～3．27(m，4H，2 ×2＇-H)，2．74～2．65(m，4H，2 ×3＇-H)，2．33(s，3H，CH3)，1．28～1．25(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):492［M +H］+;Anal．calcd．for C26H26FN6O4:C 63．53%，H 5．33%，N 14．25%;Found:C 63．74%，H 5．18%，N 14．57%。

4-磺酰胺基-苯甲醛縮N-甲基環(huán)丙沙星酰腙(化合物4l):收率81%;mp ＞260℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．25(s，1H，CONH)，8．92(s，1H，2-H)，8．48(s，1H，N = CH)，8．12(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，8．06(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．87(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．73(s，2H，H2N)，7．66(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．76～3．71(m，1H，1＇-H)，3．40～3．31(m，4H，2 ×2＇-H)，2．78～2．67(m，4H，2 ×3＇-H)，2．35(s，3H，CH3)，1．19～1．32)，m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS (m/z):527 ［M + H］+;Anal．calcd．for C25H27FN6O4S:C 57．02%，H 5．17%，N 15．96%;Found:C 57．25%，H 5．36%，N 16．18%。

2．2 體外抗腫瘤篩選結(jié)果 見表1。

表1 化合物4a～4l 對SMMC-7721、L1210 和HL60 細胞的IC50(n=3) μmol/L

3 討論

環(huán)丙沙星與甲酸和甲醛通過Eschweiler-Clarke反應(yīng)在C-7 哌嗪基進行甲基化，制得N-甲基環(huán)丙沙星，接著與水合肼發(fā)生肼解反應(yīng)得N-甲基環(huán)丙沙星酰肼，進一步與芳香醛縮合得目標化合物酰腙。

該研究結(jié)果表明，12個酰腙目標化合物對3種腫瘤細胞的抑制活性(IC50＜50．0 μmol/L)雖然低于DOX，但均顯著強于母體環(huán)丙沙星;對肝癌細胞(SMMC-7721)的抑制活性高于對白血病細胞(L1210 和HL60)，顯示出了一定的選擇性。初步的構(gòu)-效關(guān)系表明，當(dāng)苯環(huán)含有吸電子取代基如羧基或磺酰胺基時，其抗腫瘤活性強于其他取代基化合物的活性，其IC50已達到μmol/L，這可能是吸電子基團能夠活化酰腙亞胺雙鍵，有利于與作用靶發(fā)生親核加成而產(chǎn)生細胞毒作用;同時，除帶有酚羥基外，隨著苯環(huán)取代基體積的增大，活性降低。由此可初步知道，由抗菌氟喹諾酮發(fā)展抗腫瘤氟喹諾酮時，沒有必要保留C-3 羧基，可用等排體酰腙替代，這為進一步的結(jié)構(gòu)修飾提供了重要的依據(jù)和方法。

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