HPV16相關宮頸癌細胞系和組織中E7和DRR1蛋白的表達*

王 虹，李 娜，付琳琳，吳 余，田明振，李 航，馮思佳，楊 璐，趙二趁，千新來

新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理學教研室新鄉(xiāng)453003

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，約80%是鱗狀細胞癌［1］。世界范圍內每年有50 萬新增宮頸癌病例，死亡27．4 萬例［2］。人乳頭瘤病毒(human papilloma viruses，HPVs)感染是引起宮頸癌和癌前病變的主要原因［3］，在15個高危HPVs 中，HPV16是目前最主要的類型［4］。早起基因E7 編碼的E7蛋白持續(xù)表達是高危HPVs 致癌的關鍵，其可通過結合并降解pRb 蛋白等，導致細胞異常增殖［5］。人腎細胞癌下調基因1(down-regulated in renal cell carcinoma 1，DRR1)定位于染色體的3p21．1，其蛋白產物廣泛表達于正常組織，但在許多癌細胞系和原發(fā)性腫瘤組織中表達明顯降低，如腎細胞癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、非小細胞肺癌等［6］。DRR1 作為腫瘤抑制基因可能在細胞癌變過程中發(fā)揮重要作用［7］。該研究從細胞和組織水平檢測DRR1 表達與E7 表達的關系，試圖為HPV16 相關宮頸癌的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞系及培養(yǎng)條件 HPV16 陽性的宮頸癌CaSki 細胞和SiHa 細胞，以及HPV16 陰性的宮頸癌C-33A 細胞均購自中科院上海細胞庫。培養(yǎng)條件:高糖DMEM 培養(yǎng)基(美國Invitrogen 公司)，內含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，于37℃、體積分數5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1．1．2 宮頸癌標本的收集與處理 從新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院和新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院收集宮頸鱗狀細胞癌組織標本，共184例，每例標本常規(guī)制備石蠟切片3 張，1 張用于HE 染色以進一步確診，其余2張用于HPV16 E7 和DRR1 蛋白的檢測。

1．1．3 主要試劑及儀器 鼠抗人β-actin 單克隆抗體、鼠抗人HPV16 E7 單克隆抗體、ECL 試劑盒和辣根酶標記的兔抗鼠二抗購自美國Santa Cruz 公司，鼠抗人DRR1 單克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品。通用型PV9000 二步法免疫組化檢測試劑盒購自美國Zymed 公司。超凈工作臺(SW-CJ-1F)購自蘇州凈化設備有限公司，倒置顯微鏡(TE2000-U)購自日本Nikon 公司，半干轉膜儀(TE-70)購自美國Amersham Biosciences 公司，微波爐購自廣東格蘭仕公司。

1．2 宮頸癌細胞中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的檢測 采用Western blot 方法檢測。收集CaSki、SiHa和C-33A 細胞，提取細胞總蛋白，按Bradford 方法進行定量，變性處理后進行SDS-PAGE 和轉膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗室溫搖育2 h，二抗室溫搖育2 h，按照ECL 試劑盒操作步驟進行顯色、曝光，最后顯影、定影、掃描。以β-actin 為內參照。蛋白上樣量均為150 μg，鼠抗人β-actin 單克隆抗體、鼠抗人HPV16 E7 單克隆抗體、鼠抗人DRR1 單克隆抗體、辣根酶標記的兔抗鼠二抗的稀釋倍數分別為1 000、300、500 和5 000。采用Bandscan 5．0 軟件分析，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1．3 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1蛋白的檢測 采用免疫組化染色法檢測。石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，于微波爐中進行抗原修復。體積分數3%H2O2中室溫封閉20 min，山羊血清室溫封閉20 min。滴加稀釋好的一抗(HPV16 E7 和DRR1 一抗稀釋倍數均為50)，4℃孵育過夜。滴加通用型IgG 抗體-辣根過氧化物酶多聚體，室溫孵育30 min。DAB 顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。HPV16 E7 和DRR1 蛋白主要定位于細胞核，陽性信號呈棕黃色顆粒樣著色。高倍鏡下選取5個視野進行觀察:①按陽性細胞百分比計分，＜30%、30%～70%及＞70%各記為1、2 和3 分。②按切片中細胞著色深淺評分，無著色和淺黃色、棕黃色、棕褐色著色各記為0 分和1、2、3 分。取兩項評分之和作為總積分，總積分0～1 分為陰性，≥2 分為陽性。

1．4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 16．0 進行分析。3種細胞中DRR1 蛋白表達的比較采用單因素方差分析及LSD-t 檢驗;宮頸鱗狀細胞癌組織中DRR1 和HPV16 E7 蛋白表達的分析采用χ2檢驗;檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 宮頸癌細胞中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的表達 見圖1、表1。C-33A 細胞中未見HPV16 E7 蛋白表達，CaSki 和SiHa 細胞中可見HPV16 E7 蛋白表達。C-33A 細胞中DRR1 蛋白表達顯著高于CaSki和SiHa 細胞，CaSki 細胞和SiHa 細胞中DRR1 蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 宮頸癌細胞中HPV16 E7(上)和DRR1(下)蛋白的表達

表1 宮頸癌細胞中DRR1 蛋白的表達

2．2 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1蛋白的表達 宮頸鱗狀細胞癌組織184例，其中HPV16 E7 陽性141例，陰性43例(圖2)。HPV16 E7 陽性宮頸鱗狀細胞癌組織中DRR1 蛋白的表達顯著低于HPV16 E7 陰性組織，見圖2、表2。

圖2 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的表達(SP，×400)

表2 宮頸鱗狀細胞癌組織中HPV16 E7 和DRR1 蛋白的表達例

3 討論

高危型HPVs 感染是宮頸癌的主要病因，全球超過一半的病例由HPV16 感染引起［8］。高危型HPVs 的早起基因E7 表達的E7 蛋白可直接使pRb失活，因此，E7 是強有力的細胞增殖誘導者，其可顯著降低基因組的穩(wěn)定性，使宿主細胞傾向于向腫瘤發(fā)展，E7 被認為是宮頸癌診斷和治療的靶點［9］。目前尚沒有可用于HPVs 相關疾病治療的有效方法［10］，宮頸癌治療多采用綜合治療方案。因此，深入研究HPV16 的致癌機制對探索HPV16 相關腫瘤新的治療方法具有重要意義。

人DRR1 基因最初由Yamato 等克隆得到，用突變型DRR1 轉染腎細胞癌和其他腫瘤細胞系可以抑制細胞增殖。DRR1 的再表達可抑制癌細胞的生長并誘導細胞凋亡［11］。轉染該基因到DRR1 陰性的癌細胞系中可觀察到明顯的細胞生長阻滯［12］。因此，DRR1 作為腫瘤抑制基因可能在癌變過程中發(fā)揮重要作用。

該研究中，Western blot 結果顯示:C-33A 細胞不表達HPV16 E7 蛋白，其DRR1 的表達顯著高于CaSki 細胞和SiHa 細胞;CaSki 細胞和SiHa 細胞表達HPV16 E7 蛋白，二者DRR1 蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義。免疫組化結果顯示:HPV16 E7 蛋白陽性的宮頸鱗狀細胞癌組織中DRR1 蛋白的表達顯著低于HPV16 E7 陰性組織。上述結果說明無論是宮頸癌細胞系還是宮頸癌組織，E7 與DRR1 的表達均呈負相關。據此初步推測，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，HPV16 E7 可能通過直接或間接抑制DRR1 的表達而發(fā)揮其致癌作用，關于E7 與DRR1 具體的相互作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，DRR1 可能是HPV16 E7 作用的潛在靶基因，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在HPVs 相關腫瘤的治療上可能有廣泛的應用前景。

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