氯通道阻斷劑DIDS對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響*

任京力，林 玲，王雁梅，王福青，李超彥，蔡智慧，常全忠

1)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系藥理學(xué)教研室 漯河462002 2)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部生理學(xué)教研室 漯河462002 3)遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室 珠海519041

缺血性腦損傷是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，具有較高的發(fā)病率、致殘率和病死率。缺血中心區(qū)神經(jīng)元的壞死是不可挽救的死亡形式，而缺血周邊區(qū)神經(jīng)元的凋亡是一種受程序控制的主動(dòng)死亡形式，闡明凋亡機(jī)制并尋找有效的靶點(diǎn)拮抗藥物顯得十分重要。氯離子的活動(dòng)可能參與了缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的過程，4，4'-二異硫氰基芪-2，2'-二磺酸(4，4'-diisothiocyanostibibene-2，2'-disulfonic acid，DIDS)作為一種氯離子通道阻斷劑可以拮抗離體神經(jīng)元的凋亡［1-3］。為進(jìn)一步探討DIDS 的抗凋亡機(jī)制，作者利用H2O2誘導(dǎo)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株P(guān)C12 細(xì)胞凋亡，觀察DIDS 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、H2O2購自Gibco 公司，Bcl-2 抗體、Caspase-3 多克隆抗體購自Sigma 公司。倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯2X71)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜電泳裝置(北京六一儀器廠)，流式細(xì)胞儀(美國BD FACSCALIBUR)。

1．2 實(shí)驗(yàn)分組 高分化PC12 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。參考文獻(xiàn)［4］，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，隨機(jī)分為9組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)12 h;余8組細(xì)胞分別用400 nmol/L H2O2與0(模型組)、5、10、50、100、200、300、400 μmol/L DIDS 培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h 后，收集各組細(xì)胞，測定細(xì)胞存活率，選取最佳DIDS 濃度組進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1．3 MTT 法測定細(xì)胞存活率 具體操作參照文獻(xiàn)［5-6］。細(xì)胞存活率=(吸光度實(shí)驗(yàn)組－吸光度空白)/(吸光度對(duì)照組－吸光度空白)×100%。

1．4 Western blot 法檢測Caspase-3 和Bcl-2 蛋白參照文獻(xiàn)［6-7］。取對(duì)照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細(xì)胞，用冰冷的0．1 mol/L PBS 洗滌2次，加裂解液收集細(xì)胞，低溫離心，收取上清液測定蛋白濃度并用上樣緩沖液調(diào)整，煮沸10 min 后加樣，SDSPAGE 電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)移，胎牛血清封閉液封閉，加Caspase-3 多克隆抗體(1∶1 000)和Bcl-2 單克隆抗體(1∶800)，4℃過夜，加HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫反應(yīng)2 h 后，ECL 顯影。以β-actin 為內(nèi)參。Western blot 結(jié)果用Quantity One 定量分析軟件進(jìn)行分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/βactin 條帶灰度值。

1．5 凋亡率的檢測 參照文獻(xiàn)［8］。取對(duì)照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細(xì)胞，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，500 r/min 離心，PBS 清洗，離心后收集細(xì)胞，用Binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入Annexin VFITC 混勻后再加入5 μL 碘化丙啶，室溫避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間細(xì)胞存活率、凋亡率、Caspase-3 和Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組細(xì)胞存活率的比較 見表1。結(jié)果顯示，400 nmol/L H2O2可以明顯誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率僅35．07%;DIDS 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷具有拮抗作用，且具有一定的濃度依賴性。

表1 各組細(xì)胞存活率的比較

2．2 對(duì)照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細(xì)胞Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的比較 見圖1、表2。結(jié)果顯示，模型組Caspase-3 蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，Bcl-2 蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱;而與模型組比較，100 μmol/L DIDS組Caspase-3 表達(dá)減弱，Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。

圖1 3組細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白的Western blot 檢測

2．3 對(duì)照組、模型組和100 μmol/L DIDS組細(xì)胞凋亡率的比較 見表2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組和100 μmol/L DIDS組細(xì)胞凋亡率均增加，但100 μmol/L DIDS組細(xì)胞凋亡率較模型組明顯降低。

表2 3組細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)及凋亡率的比較

3 討論

PC12 細(xì)胞株是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，具有神經(jīng)細(xì)胞的一般特征，因其具有可傳代的特點(diǎn)，故廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究［9］。該實(shí)驗(yàn)選用的是高分化PC12 細(xì)胞株。H2O2是一種常用的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化學(xué)試劑，該實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［4］并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用400 nmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

DIDS 是一種芪衍生物，是一種陰離子通道阻斷劑，對(duì)氯離子通道具有非特異性的阻斷作用［10］。有資料［11］顯示，DIDS 對(duì)NO 誘導(dǎo)的離體大鼠海馬神經(jīng)元凋亡具有一定的保護(hù)作用，但機(jī)制尚不清楚。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DIDS 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性拮抗作用。Caspase-3 和Bcl-2 是與細(xì)胞凋亡有直接關(guān)系的凋亡蛋白分子?；钚訡aspase-3 蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，正常情況下在細(xì)胞內(nèi)很少被激活。Bcl-2 蛋白是一種抗凋亡蛋白［12-13］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DIDS組細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)較模型組明顯降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，提示DIDS 具有拮抗H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡的作用。據(jù)此作者推測，DIDS 可能通過Caspase-3 依賴性信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用。氯通道可能參與了H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的凋亡［3］。氯通道蛋白與凋亡信號(hào)通路之間的聯(lián)系有待于進(jìn)一步研究。

［1］李曦，尹金寶，鐘志超，等．DIDS 對(duì)SIN-1 誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及PARP-1/AIF 表達(dá)的影響［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(11):1549

［2］鐘志超，范紅領(lǐng)，尹金寶，等．氯通道電流在離體大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中變化及SITS 的拮抗作用［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(3):367

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