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    石油烴降解菌的分離及在含油污泥中的應用

    2015-12-03 09:04:18姚力芬1丹1陳麗華2李廣彬1孫盼盼1李佳釀3
    現(xiàn)代鹽化工 2015年6期
    關鍵詞:堆體菌劑數(shù)量

    姚力芬1 李 丹1 陳麗華2 李廣彬1 孫盼盼1 李佳釀3

    (1.西北民族大學 化工學院,甘肅 蘭州,730030;2.西北民族大學 實驗中心,甘肅 蘭州,730030;3.西北民族大學 電氣工程學院,甘肅 蘭州,730030)

    近年來,石油污染的環(huán)境污染問題已越來越引起人們的廣泛關注,在治理石油污染的方法中,生物修復法因其獨特的優(yōu)勢受到廣泛關注[1]。篩選出高效降解石油烴降解菌是生物修復的必然,目前有關石油降解菌方面的研究報道較多[2-3]。本文從甘肅隴東長慶油田中取得含油污泥,從中分離篩選得到六株降解石油烴菌株,并將其制得混合菌劑,同時進行了混合菌劑處理含油污泥的小試實驗,為以后的實際應用奠定基礎。

    1 實驗材料

    1.1 含油污泥

    試驗所用油泥采自甘肅隴東油區(qū)。油泥的TPH含量為50g/kg,含水率為25%,pH為7.82。

    2 實驗方法

    2.1 菌株分離

    根據(jù)雒曉芳[4]等人的分離方法,取土樣2.5g,加入到有200mL無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中,在30℃,120r/min的恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)7d,移取一定量的富集培養(yǎng)液接入新鮮降油培養(yǎng)基中,在相同條件下培養(yǎng)7d,相同操作共重復3次,經過3個周期的馴化后,在無菌條件下,用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液,在降油培養(yǎng)基的平板上劃線后,平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~72h,然后將代表性較好的菌落在降油培養(yǎng)基平板上反復劃線純化得到單一菌落,再將純化的菌株接種至斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,保存于4℃冰箱中,待用。

    2.2 菌株的鑒定

    (1)常規(guī)鑒定:參照《微生物學實驗》[5],對篩選得到的六株菌株進行了菌落特征及菌體形態(tài)特征觀察。

    (2)生理生化鑒定:參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]首先將篩選出來的六株菌進行復活,在無菌條件下,分別各挑取少量菌加入生化管中,密封,放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察現(xiàn)象,平行做兩組實驗。

    2.3 混合菌劑的發(fā)酵

    2.3.1 菌劑的復活

    將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制好后,分裝于試管中,每支試管約4-5mL,后將所有所需儀器高壓滅菌,滅菌條件:121℃,20min,50℃保存。隨后在超凈臺上進行接種,接種完后在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h,保存進行下一步工作。

    2.3.2 一次擴培

    將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制好后,分裝于三角瓶中,每個三角瓶約10mL,后將所有所需儀器高壓滅菌,滅菌條件:121℃,20min,50℃保存。隨后在超凈臺上進行接種,接種完后在恒溫搖床培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h,保存進行下一步工作。

    2.3.3 發(fā)酵

    做好發(fā)酵罐的滅菌工作,然后進行接種,即倒入由a1、a2、a3、a4、a5、a6這六株菌(前三株所占體積百分數(shù)為50%,后三株為50%)按體積比為1:1:1:1:1:1配成菌懸液。

    2.4 生長曲線的測定

    按照文獻[5],對于在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵的混合菌劑,每三小時取樣一次,冷卻后放入冰箱,48h后統(tǒng)一用752型紫外可見分光光度計測定其OD值。

    2.5 TPH降解率的測定

    根據(jù)參考文獻[7],土壤中石油類物質的測定采用紫外分光光度法。采用索式提取法提取土壤中石油類物質,利用紫外分光光度計測出相對應的吸光度,計算每千克干土中石油類物質含量,進而計算出石油類物質降解率 w:

    其中w1: 為第1天土壤中石油類物質含量,mg/kg;mi為第i天土壤中石油類物質含量,mg/kg。紫外分光光度法測得原油的標準方程為:

    其中:相關系數(shù)R2為0.5591。

    為方便計算,將其轉變?yōu)?50 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關系式為:

    其中:D為用250mL石油醚萃取含油土樣得到萃取液的有效吸光度,無量綱;M為樣品所含石油類污染物總量,mg。

    2.6 微生物計數(shù)法

    根據(jù)參考文獻[8]土壤中微生物數(shù)量測定采用平板菌落計數(shù)法。

    2.7 實驗設計

    本實驗的調節(jié)劑選擇的是容易取材的玉米秸稈,玉米秸稈提前粉碎備用,有機肥選用的是風干牛糞(C/N比為26,速效氮含量為1.7%),并按照油泥(濕重)與玉米秸稈的比例為98:2,油泥(濕重)與有機肥的比例為3:80的,含水率為50%來混合材料。

    實驗設計兩個處理,實驗組和對照組,兩個處理均在室內同一條件下進行,底層鋪上防滲塑料布,將所有物料倒在塑料布上,攪拌均勻,堆置起來。同時在兩個堆體里加入發(fā)酵菌劑。上面覆蓋塑料薄膜,以保溫和保濕。中間插入通氣管,通氣管上每隔10cm打一個直徑為1cm的孔,通氣管外接通風設備,以在發(fā)酵過程中控制氧含量。在堆體上分別設置四個監(jiān)測點,測量堆體溫度,并動態(tài)監(jiān)測堆肥過程中堆體的PH、溫度等。當堆體的溫度經歷了升溫,高溫,降溫三個階段,并在溫度降低至40℃左右時,向實驗組堆體里按照5%的比例加入混合降油菌劑,25天時補加一次降油菌劑。對照組不添加菌劑。每7天采樣,測定實驗組和對照組微生物數(shù)量、脫氫酶活性及降油率的變化。

    3 結果與討論

    3.1 菌株的鑒定

    3.1.1 常規(guī)鑒定

    對篩選得到的六株菌株進行了菌落特征及菌體形態(tài)特征觀察,以下是各菌株的革蘭氏染色和簡單染色的效果圖示。

    鏡檢結果如下圖1及表1所示:

    表1 菌落的形狀、質地、顏色及形態(tài)

    3.1.2 生理生化測試

    首先將篩選出來的六株菌進行生理生化實驗,實驗結果如下表2所示。

    表2 生理生化試驗鑒定結果

    符號說明:“+”表示該項反應結果為陽性;“-”表示該項反應結果為陰性。

    3.1.3 菌種鑒定結果

    根據(jù)鏡檢和生理生化試驗結果對照,得到以下結果如表3所示。

    表3 常規(guī)鑒定實驗結果

    3.2 混合菌劑生長曲線的測定

    根據(jù)圖2可知,混合菌在發(fā)酵開始時由于剛剛進入新的環(huán)境,開始時的0~3h菌體處于生長遲緩期,3~21h時間段內菌體迅速生長,處于對數(shù)生長期,21h時菌體吸光度值達到最大值為。21h后菌體生長趨勢開始進入穩(wěn)定期,所以發(fā)酵菌劑時間選定為24h。

    圖2 混合菌劑生長曲線

    3.3 微生物數(shù)量與TPH降解率的變化關系

    控制其他影響條件基本相同,如溫度、酸度、堿度、電導率、C/N、堆體的通氣情況,均在微生物的最適范圍子內。在不考慮其他變量的情況下,以是否加入石油烴降解菌劑作為唯一變量,討論對照組和實驗組微生物數(shù)量與降解幅度的關系。

    由圖3可知,微生物的數(shù)量與降解幅度在總體上基本呈相關關系,因微生物數(shù)量較多時,石油烴類化合物被大量分解,降解幅度較大。堆肥0天時,在實驗組加入發(fā)酵菌劑和石油烴復合降解菌劑。此時,堆體的細菌數(shù)較多(約155×107個/g),微生物處于遲滯期,開始適應環(huán)境,不能適應環(huán)境的微生物會死亡,數(shù)量稍有降低。適應環(huán)境的微生物開始利用堆體中的有機物合成自身的細胞結構,遲滯末期,細胞個體變大,開始分裂。此時,細菌數(shù)雖稍有下降,但微生物數(shù)量仍較高,微生物利用石油作為能源進行新陳代謝,堆體中的石油烴類化合物被分解,降解幅度較大(約12%)。從第5天到第17天,微生物數(shù)量增長較快,達到最大340*107個/g,此時,微生物處于對數(shù)期,細菌利用堆體中的營養(yǎng)物質合成細胞結構大量繁殖,分解堆體中復雜有機物為較簡單的有機物。因堆體為牛糞,纖維素含量較高,有機質含量較低,一次發(fā)酵菌劑主要是分解纖維素為較簡單的糖類,利于降油菌劑分解。此時,堆體中的石油烴類化合物被微生物大量分解,降解幅度達到最大(35%左右)。

    圖3 微生物數(shù)量與TPH降解率的關系

    從第17天到24天,細菌數(shù)量開始下降,細菌開始進入穩(wěn)定期,營養(yǎng)物質稱為主要的限制因素。此時,能被一次發(fā)酵菌劑降解的纖維素已基本被分解,其他營養(yǎng)物質含量也較低,細菌所需營養(yǎng)物質不夠,停止生長分裂,細胞內的有害代謝產物開始積累;當進入衰亡期時,細菌所需營養(yǎng)物質已消耗殆盡,細菌開始進入內源消耗,細胞內的有害代謝產物大量積累,影響細菌的生理活動,此時細菌開始死亡,微生物數(shù)量下降達到最低(約150×107個/g)。當微生物數(shù)量下降時,細菌的降解幅度開始下降,微生物數(shù)量達到最低時,降解幅度為負(約-12%),說明含油量相比上次增加,當微生物死亡時,部分石油烴類殘存在微生物殘體內,并未被分解,或是細菌的代謝物中含有短鏈的脂肪烴類物質,所以含油量增高,降解幅度為負。

    從37天開始,對照組加入二次降解菌劑(六株高效降解石油烴類的復合菌劑),微生物數(shù)量又開始大幅度增加(達到400*107個/g),大量利用石油烴類化合物合成細胞自身結構,降解幅度達到隨之增加(達到18%)。此后,微生物數(shù)量開始逐漸降低趨于穩(wěn)定,并逐步接近土壤本底值,降解幅度也趨于穩(wěn)定。

    對照組采用未加入降解菌劑的含油污泥和牛糞的堆肥實驗,控制所有變量與實驗組保持相同,由圖3可知,在堆體開始發(fā)酵時,堆體內的微生物也經歷適應期,對數(shù)期,穩(wěn)定期和衰亡期,數(shù)量稍有變化,但由于對牛糞中的纖維素利用率較低,造成營養(yǎng)不足,難以大量降解石油烴類化合物,降解幅度幾乎不變(維持在4%左右)。

    4 結論

    本研究從被長期被原油污染污染的土壤中分離篩選方法篩選出6種降油菌(a1~a6),并通過常規(guī)鑒定和生理生化試驗,得到a1、a2、a3均為芽孢桿菌,a4、a6均為假單胞菌,a5為不動桿菌。通過細菌的復活,一次擴培,發(fā)酵操作,制得混合菌劑。

    在實驗室中進行微生物修復石油污染土壤的小試實驗,結果表明,當土壤中石油含量為50g/kg時,加入混合菌劑的石油降解率比沒有加菌劑的降解效率高,添加5%菌劑81d的降解率為90.20%,均大于對照組(只添加有機肥)的降解率31.10%,說明了該混合菌劑具有應用于實際石油污染土壤生物修復的潛力。

    [1] 商雪嬌,李思,張金輝.生物法處理含油污泥的研究進展[J].當代化工,2014,43(4):622-624.

    [2] 劉鵬,李大平,王曉梅,等.石油污染土壤的生物修復技術研究[J].化工環(huán)保,2006,26(2):91-94.

    [3] Belhaj A,Desnoues N,Elmer ich C.Alkane biodegradation in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a polluted zone:Identification of alkB and alkB-related genes[J].Res Microbiol,2002,153(6):339-344.

    [4] 雒曉芳,陳麗華,王冬梅,等.兩株降油菌株的分離及其降油特性[J].中國釀造,2012,31(10):72-74.

    [5] 沈萍,陳向東.微生物學實驗(第4版)[M].北京:高等教育出版社,2007.

    [6] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

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    [8] 李洪梅,郜玉環(huán),江麗華,等.不同濃度石油烴對油菜產量、土壤中石油烴殘留量及土壤微生物的影響.中國農學通報,2010.26(17):382-385.

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