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    防感合劑的定性定量方法優(yōu)化研究

    2015-12-03 09:04:16張傳仙高驍君倪文澎
    現(xiàn)代鹽化工 2015年6期
    關(guān)鍵詞:鑒別方法甲苷白芍

    張傳仙 高驍君 倪文澎

    (江蘇省中醫(yī)院藥學部,江蘇 南京 210029)

    江蘇省中醫(yī)院制劑防感合劑是我院著名中醫(yī)兒科泰斗江育仁教授經(jīng)驗方,由古方桂枝加龍骨牡蠣湯并加黃芪而成。方中桂枝辛溫,甘草甘溫,二藥相合,有辛甘化陽之功,以鼓舞衛(wèi)陽;白芍味酸,與甘草合用酸甘化陰,以補營陰之不足;姜棗內(nèi)可調(diào)脾胃,外可和營衛(wèi),脾胃健而營衛(wèi)通。龍骨、牡礪同具潛陽斂陰之功用。黃芪益氣固表,實衛(wèi)而斂汗,且具有較強的健脾之功;陳皮、白術(shù)健脾理氣。臨床用于防治小兒呼吸道感染,療效確切[1]。

    作為醫(yī)院制劑,其質(zhì)量標準中,鑒別項僅對白芍所含的白芍苷進行薄層鑒別,未對處方中其他藥味進行鑒別,更沒有含量測定。實驗研究中,我們在防感合劑原標準的基礎(chǔ)上,對白芍的薄層鑒別方法進行了耐用性試驗,并增加了炙黃芪和白術(shù)的薄層色譜鑒別,用HPLC-ELSD方法對方中君藥炙黃芪中黃芪甲苷建立了含量測定方法[2]。實驗結(jié)果表明,建立的方法可靠,重現(xiàn)性好,可以更好地控制制劑的質(zhì)量。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    凝膠成像分析儀(型號WD-9413A,北京市六一儀器廠);電熱恒溫鼓風干燥箱(型號DHG-9123A,上海精宏實驗設(shè)備儀器廠);醫(yī)用超聲波清洗儀,型號KQ-1000E,昆山市超聲儀器有限公司;薄層色譜展開槽、硅膠-0.5CMCNa板(自制);Waters2695高效液相色譜儀;Alltech-2000型ELSD檢測器,電子分析天平(BP-211D型,德國賽多利斯公司)。

    1.2 試藥

    白芍對照藥材(批號120905-201109,中國食品藥品檢定研究院);芍藥苷對照品(批號110736-201337,中國食品藥品檢定研究院);黃芪甲苷對照品(批號110781-201314,中國食品藥品檢定研究院);白術(shù)對照藥材(批號110786-200503,中國食品藥品檢定研究院);防感合劑(批號1401001、1401002、1401003,江蘇省中醫(yī)院制劑部);乙腈、甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 定性鑒別

    防感合劑制劑處方由十一味中藥組成,原制劑薄層鑒別僅白芍一味飲片的鑒別,現(xiàn)對白芍的鑒別進行了方法學研究,并增加本制劑中炙黃芪、白術(shù)薄層色譜鑒別試驗。

    2.2.1 白芍的薄層鑒別

    2.2.1.1 白芍的薄層鑒別方法的建立

    供試品溶液的制備:取防感合劑10ml,用正丁醇萃取兩次,每次30ml,合并正丁醇萃取液,用氨試液洗滌兩次,每次20ml,棄去氨試液,將正丁醇液水浴蒸干,殘渣加無水乙醇1ml溶解,作為供試品溶液;

    陰性樣品溶液的制備:按防感合劑制備方法制備缺白芍藥材的陰性制劑,按上述方法制備陰性樣品溶液;

    白芍對照藥材溶液的制備:取白芍對照藥材粉末0.5g,加乙醇10ml,振搖5分鐘,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇1ml使溶解,作為對照藥材溶液。

    芍藥苷對照品制備:取芍藥苷對照品,加乙醇制成每1ml含2mg的溶液作為對照品溶液。

    薄層層析:參照薄層色譜法(《藥典》一部附錄ⅥB) [3],在同一硅膠G薄層板上,吸取上述三種試液各4μl分別點樣,展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2),取出,晾干,噴5%香草醛硫酸試液,105℃烘干至斑點清晰。

    在硅膠G板上,與對照品色譜相應(yīng)的位置上,供試品溶液顯相同顏色的斑點。該法分離度好,陰性樣品沒有干擾,用此法對三批樣品進行同步試驗,三批均能檢出,結(jié)果如圖1,擬建立白芍的鑒別標準。

    圖1: 防感合劑中白芍薄層圖譜

    2.2.1.2 白芍鑒別方法的耐用性考察[4]

    2.2.1.2.1 不同薄層板的耐用性考察

    取上述的供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液各4μl,分別點于自制的硅膠G板與青島海洋化工廠預制硅膠G上,按2.2.1.1建立的白芍薄層鑒別方法實驗,結(jié)果如圖2、圖3。從圖中可知,兩種板分離度均可,預制板中主斑點的Rf值較小,可能與制板時粘合劑的濃度有關(guān),并沒有影響分離效果。進行了三批樣品多次實驗,重現(xiàn)性良好。

    2.2.1.2.2 溫濕度對分離度的影響

    取上述的供試品溶液、陰性溶液、對照品溶液各4μl,分別點于兩相同來源硅膠G板上,按

    圖2: 自制硅膠G板白芍薄層結(jié)果圖

    圖3:預制G板白芍薄層結(jié)果圖

    2.2.1.1建立的薄層鑒別條件,分別在溫度25℃、濕度50%和溫度30℃、濕度70%兩條件下展開,取出,晾干,顯色。結(jié)果如圖4、圖5。結(jié)果顯示,分離度較好,重現(xiàn)性好。

    圖4: 25℃、50%白芍薄層鑒別結(jié)果圖

    圖5: 30℃、50%白芍薄層鑒別結(jié)果圖

    2.2.2 炙黃芪薄層鑒別

    2.2.2.1 炙黃芪的薄層鑒別方法的建立

    供試品溶液制備:取防感合劑50ml,用水飽和的正丁醇振搖提取2次,每次30ml,合并萃取液,氨試液洗滌至無色,棄去氨試液,用蒸餾水洗滌2-3次,每次30ml,將正丁醇液水浴蒸干,殘渣加甲醇1ml使溶解,作為供試品溶液;

    陰性樣品溶液的制備:按防感合劑制備方法制備缺炙黃芪的陰性制劑,按上述方法制備陰性樣品溶液;

    對照品制備:取黃芪甲苷對照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作為對照品溶液。

    薄層層析:參照薄層色譜法(《藥典》一部附錄ⅥB) [2],在同一硅膠G薄層板上,吸取上述三種試液各2μl分別點樣,展開劑為三氯甲烷-甲醇-20%氫氧化鈉(13:7:2)的下層溶液,取出,晾干,噴10%硫酸乙醇溶液,105℃烘干至斑點清晰。

    在硅膠G板上,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,供試品溶液在日光下顯相同棕褐色斑點;紫外燈光(365nm)下顯相同橙黃顏色的斑點。此方法分離度好,陰性樣品沒有干擾,用此法對三批樣品進行同步試驗,均能檢出,結(jié)果如圖6。擬建立炙黃芪的鑒別標準。

    圖6 :防感合劑炙黃芪薄層圖譜

    2.2.2.2 炙黃芪鑒別方法的耐用性考察[4]

    2.2.2.2.1 不同薄層板的耐用性考察

    取上述供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液各2μl,分別點于自制的硅膠G板與青島海洋化工廠硅膠G,按2.2.2.1建立的炙黃芪薄層鑒別方法實驗,結(jié)果如圖7、圖8。從圖中可知,兩種板分離度均可,預制板中主斑點的Rf值較小,可能與制板時粘合劑的濃度有關(guān),并沒有影響分離效果。進行了三批樣品多次實驗,重現(xiàn)性良好。

    圖7: 自制硅膠G板炙黃芪薄層結(jié)果圖

    圖8: 預制硅膠G板炙黃芪薄層結(jié)果圖

    2.2.2.2.2 溫濕度對分離度的影響

    取上述的供試品溶液、陰性溶液、對照品溶液各2μl,分別點于兩相同來源的硅膠板上,按2.2.2.1建立的薄層鑒別條件,分別在溫度25℃、濕度50%和溫度30℃、濕度70%兩條件下展開,取出,晾干,顯色。結(jié)果如圖9、圖10。結(jié)果顯示,分離度較好,重現(xiàn)性好。

    2.2.3 白術(shù)薄層鑒別

    2.2.3.1 白術(shù)的薄層鑒別方法的建立

    供試品溶液制備:取防感合劑50ml,用正己烷萃取兩次,每次20ml,合并萃取液,揮干,殘渣加2ml乙醇溶解,作為供試品溶液;

    陰性樣品溶液的制備:按防感合劑制備方法制備缺白術(shù)的陰性制劑,按上述方法制備陰性樣品溶液;

    圖9: 25℃、50%炙黃芪薄層鑒別結(jié)果圖

    圖10: 30℃、50%炙黃芪薄層鑒別結(jié)果圖

    對照藥材制備:取白術(shù)對照藥材粉末1g,加正己烷4ml,超聲30min,過濾,濾液作為對照藥材溶液。

    薄層層析:參照薄層色譜法(《藥典》一部附錄ⅥB),在同一硅膠G薄層板上,吸取上述三種試液各10μl分別點樣,展開劑為環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:2),取出,晾干,噴10%硫酸乙醇溶液,烘干,置365nm紫外燈下檢視。

    在硅膠G板上,與對照藥材色譜相應(yīng)位置上,供試品溶液顯相同顏色的熒光斑點。此方法分離度好,陰性樣品沒有干擾,用此法對三批樣品進行同步試驗,均能檢出,結(jié)果如圖11,擬建立白術(shù)的鑒別標準。

    2.2.3.2 白術(shù)鑒別方法的耐用性考察[4]

    2.2.3.2.1 不同薄層板的耐用性考察

    取上述的供試品溶液、陰性對照溶液、對照品溶液各10μl,點于自制的硅膠G板與青島海洋化工廠預制硅膠G,按2.2.3.1建立的白術(shù)薄層鑒別方法實驗,結(jié)果如圖12、圖13。從圖中可知,兩種板分離度均可。進行了三批樣品多次實驗,重現(xiàn)性良好。

    2.2.3.2.2 溫濕度對分離度的影響

    圖11: 防感合劑白術(shù)薄層圖譜

    圖12: 自制硅膠G板白術(shù)薄層結(jié)果圖

    圖13: 預制G板白術(shù)薄層結(jié)果圖

    上述的供試品溶液、陰性溶液、對照品溶液各10μl,分別同時點于兩相同來源的硅膠G板上,按2.2.3.1建立的薄層鑒別條件,分別在溫度25℃、濕度50%和溫度30℃、濕度70%兩條件下展開,取出,晾干,顯色。結(jié)果如圖14、圖15。結(jié)果顯示,分離度較好,重現(xiàn)性好。

    上述薄層鑒別方法的耐用性考察實驗結(jié)果顯示,斑點清晰,分離度好,Rf值合適,可以將白的薄層鑒別方法列為防感合劑的質(zhì)量標準。

    圖14: 25℃、50%白術(shù)薄層鑒別結(jié)果圖

    圖15: 30℃、50%白術(shù)薄層鑒別結(jié)果圖

    2.3 定量研究

    增加本制劑君藥炙黃芪中黃芪甲苷的含量測定項目,研究如下。

    2.3.1色譜條件[2]

    色 譜 柱:HederaC18 ODS-2(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(32:68);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μl。

    2.3.2 對照品溶液制備

    取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24h的黃芪甲苷對照品12.50mg,精密稱定,加甲醇適量,溶解,加甲醇定容置25 mL容量瓶中,制得濃度為500.00μg·mL-1的對照品溶液。

    2.3.3 供試品制備

    取防感合劑50ml,水飽和正丁醇萃取4次,每次40mL,合并萃取液,以氨試液洗滌5次,每次約40 mL,棄去氨試液,收集正丁醇液,水浴蒸干,殘渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.3.4 陰性對照溶液制備

    取炙黃芪的缺味陰性制劑,按2.3.3項下的方法處理、制備炙黃芪陰性供試品溶液[1]。

    2.3.5 專屬性試驗

    將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液分別進樣,HPLC圖見圖16。圖中可見,理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不低于5000,樣品基線平穩(wěn),分離度良好,且無陰性干擾。

    圖16 黃芪甲苷HPLC-ELSD色譜圖

    2.3.6 線性關(guān)系考察

    取上述對照品溶液,分別進樣5、10、20、30、40、50 μL,依法測定峰面積。橫坐標為進樣量對數(shù),縱坐標為峰面積對數(shù),進行分析,得y =1.6909x + 5.1937,r =0.9991,結(jié)果表明黃芪甲苷在進樣量2.5~25 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系,如圖17。

    圖17 黃芪甲苷線性關(guān)系考察

    2.3.7 精密度試驗

    精密吸取對照品溶液15μl,重復進樣6次,測定并計算,結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計算RSD為0.68%。

    2.3.8 穩(wěn)定性試驗

    取同一供試品溶液(批號1408001),按上述色譜條件,分別于0、2、4、8、12 、24h進樣,進樣量為20μl,經(jīng)測定并計算,結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計算RSD為1.35%,說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.3.9 重復性試驗

    取供試品溶液(批號1408001),分6份,進樣20μl,測定,計算,結(jié)果平均含量為:黃芪甲苷0.048 mg·mL-1,RSD以黃芪甲苷含量計算為1.13%。

    2.3.10 加樣回收試驗

    精密吸取已知含量的供試品溶液(批號:1408001)6份,分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液,按2.3.3項下供試品方法配制得加樣回收的供試品溶液,進樣量為30μl,測定,計算回收率及其RSD值。結(jié)果平均回收率101.03%,RSD=0.73%值,表明方法回收率良好,準確度可靠。

    2.3.11 樣品含量測定

    分別取不同批號防感合劑(批號1401001、1401002、1401003),依上述方法制備成樣品供試品溶液,每批取3份,依法測定,結(jié)果見表1。

    表1 三批防感合劑中黃芪甲苷含量

    3 討論

    3.1 方中白芍、炙黃芪的薄層鑒別方法,斑點分離度高,直觀,重現(xiàn)性好。在本試驗中,進行耐用性實驗考察了不同薄層板(青島海洋化工廠、自制硅膠G薄層板)、不同溫度(25°C、30°C)、不同濕度(相對濕度50%、70%)對薄層鑒別的影響。結(jié)果表明,上述條件的改變對防感合劑中白芍、炙黃芪、白術(shù)的薄層鑒別沒有明顯影響。白術(shù)薄層鑒別中,參考相關(guān)文獻[5-7],展開取出晾干后,直接置于紫外燈365nm檢視,色譜斑點不清晰,故優(yōu)化方法,采用噴以10%硫酸乙醇顯色,斑點清晰,效果較好。方中防風、桂枝的薄層鑒別方法參考藥典,進行探索,但在防感合劑中鑒別點不明顯,重現(xiàn)性差,故不作為防感合劑中飲片防風和桂枝的薄層鑒別方法。

    3.2 由于方中藥材種類較多,中藥飲片的成分較復雜,不同藥材,可能含有相同的化學成分。因此,僅以化學成分對照品作為參考,特別是該成分為其非專屬性成分時,難以作為飲片的定性鑒別依據(jù)。故本文建立的薄層鑒別方法白芍、白術(shù)增加對照藥材作為參考,使得薄層定性鑒別的信息更加豐富,增強了定性鑒別的準確性與可靠性。

    3.3 炙黃芪作為方中君藥,其活性成分之一的黃芪甲苷也是特征性成分,具有補脾養(yǎng)血,益氣生津,可改善心肺功能,擴張血管,調(diào)節(jié)機體免疫功能等。由于黃芪甲苷,它有微弱的紫外末端吸收,不宜采用UV檢測器測其含量。DAD檢測器對皂苷類成分紫外末端吸收弱,選用ELSD作為檢測器,它能克服該缺點,適用于皂苷類成分的檢測,故現(xiàn)在多采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量[8-10]。本試驗所建立的黃芪甲苷含量測定方法,經(jīng)方法學考察表明所該法專屬性強,重現(xiàn)性好,可用于防感合劑的質(zhì)量控制。

    3.4 防感合劑制劑處方由十一味中藥組成,原制劑薄層鑒別僅白芍一味飲片的定性鑒別?,F(xiàn)對白芍的鑒別進行了方法學研究,建立本制劑中炙黃芪、白術(shù)薄層色譜鑒別方法和炙黃芪中黃芪甲苷的HPLC-ELSD含量測定法。以上三味藥材的薄層定性鑒別,黃芪甲苷的定量研究,經(jīng)3批樣品驗證考察,方法專屬性強、陰性無干擾,靈敏度高,重現(xiàn)性好。通過定性和定量方法兩者的結(jié)合,可以更科學、更合理、更全面地進行的質(zhì)量評價,故可作為該制劑質(zhì)量標準提高的定性依據(jù)。

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    [3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學工業(yè)出版社,2010:96.

    [4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學工業(yè)出版社,2010:附錄131.

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