黔產(chǎn)杜仲葉的1H-NMR指紋圖譜研究

黃 滔，董 芬，吳貴輝，陳 艷，顧 偉，張建新

(貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002)

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)為杜仲科杜仲屬植物，杜仲又名思仲、木棉、絲連皮等［1］。分布于陜西、甘肅、河南、湖北、四川、云南、貴州、湖南及浙江等省區(qū)，現(xiàn)各地廣泛栽種［2］。杜仲是我國特有名貴樹種，可作為藥用、膠用、材用及用作保健飲料、飼料等的原料。杜仲作為藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并列為藥之上品，具有補(bǔ)中益氣、強(qiáng)志、堅(jiān)筋骨、久服輕身耐勞的功效。杜仲從開始種到剝皮一般需要10年左右，因此僅皮作為藥源顯的資源緊缺。杜仲的化學(xué)成分研究表明，杜仲葉的化學(xué)成分與杜仲皮基本一致［3，4］，許多專家和學(xué)者證明了杜仲的葉與皮有相似的藥理作用［5-7］，以葉代皮的想法得到了進(jìn)一步證實(shí)?，F(xiàn)在杜仲葉已作為一種新藥收入《中國藥典》。本研究在前期對杜仲葉中化學(xué)成分分離純化的基礎(chǔ)上［8］，擬采用核磁共振波譜技術(shù)建立杜仲1H-NMR(Proton Nuclear Magnetic Resonance)指紋圖譜，將為杜仲葉質(zhì)量控制提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

INOVA 400 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)，譜儀控制軟件VNMR 6.1C(美國Varian公司)，氘代二甲基亞砜(美國Cambridge Isotope La-boratories公司)，電子分析天平(德國 sartorius公司)，N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司，5 mm核磁管(美國 Wilmad-LabGlass公司)。

1.2 供試樣品溶液的制備

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)葉由貴陽中醫(yī)學(xué)院付志明教授鑒定，采自貴陽市三江農(nóng)場，對照品為綠原酸、槲皮素、紫云英苷、陸地錦苷、山萘酚(均為前期從杜仲葉中分離中得到)。稱取杜仲葉粉末1.5 g，置50 mL圓底燒瓶中，加入65.0%乙醇溶液25 mL，加熱回流1 h，減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，稱取10 mg浸膏置于5 mm核磁管中，加入0.6 mL DMSO-d6溶解，取得待測液，上機(jī)。

1.3 1H-NMR測定條件

以DMSO-d6為頻率內(nèi)鎖，測定溫度 T=25℃，操作頻率399.9 MHz，脈沖序列 cpmgt2，譜寬sw=7 959 Hz，回波循環(huán)時(shí)間 d2=0.001 s，弛豫時(shí)間bt=0.1 s，采集時(shí)間at=3.744 s，脈沖延遲時(shí)間d1=10 s，采樣參數(shù)為nt=128次，脈沖寬度為sw=7 959 Hz，取得1H-NMR FID數(shù)據(jù)。并利用對照品，采用“標(biāo)準(zhǔn)樣品滴定”和JRES(J-Resolved)二維核磁共振波譜實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，鑒定從黔產(chǎn)杜仲葉總體取物的物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將測得的1H-NMR FID數(shù)據(jù)導(dǎo)入MestReNova軟件，線性加寬因子lb=1 Hz，進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換，并手動調(diào)整相位和基線，對0.5～12 ppm范圍內(nèi)的譜圖以0.04 ppm為單位進(jìn)行分段積分，并以總面積進(jìn)行歸一化處理，然后以ASCII格式輸出數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel軟件中進(jìn)行夾角余弦計(jì)算［9-10］，得到夾角余弦值。

1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批藥材粉末5份，每份2 g，按上供試樣品溶液的制備進(jìn)行處理，再按得到5組1H-NMR FID積分?jǐn)?shù)據(jù)數(shù)據(jù)，再運(yùn)用Excel軟件計(jì)算各組夾角余弦值，得到5組之間的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖序列的選擇

分別選擇譜儀自帶的s2pul(standard twopulse sequence)和cpmgt2(Carr-Purcell Meiboom-Gill T2 pulse sequence)脈沖序列，采集1HNMR譜，考察脈沖序列對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1所示。從譜圖中可以看出，采用cpmgt2脈沖序列采集1H-NMR譜(B圖)的實(shí)驗(yàn)條件，可以去除粗提取物中的大分子信號，簡化譜圖，因此選擇cpmgt2序列作為杜仲葉1H-NMR指紋圖譜的脈沖序列。

圖1 提取物1H-NMRFig.1 The1H-NMR spectrum of crude extracts

2.2 杜仲葉的1H-NMR指紋圖譜

本研究采用“標(biāo)準(zhǔn)樣品滴定”和JRES(J-Resolved)二維核磁共振波譜實(shí)驗(yàn)，從黔產(chǎn)杜仲葉總體取物中鑒定了5個(gè)化合物(圖2)，分別為綠原酸、槲皮素、紫云英苷、綠原酸甲酯、陸地錦苷及山萘酚。5個(gè)特征化合物的特征信號的化學(xué)位移及多重態(tài)分別為:綠原酸:δ7.44(d，J=16.0Hz)，7.04(s)，6.99(d，J=8.1Hz)，6.76(d，J=8.0Hz)，6.21(d，J=16.0Hz). 槲皮素:δ7.67(s)，7.54(d，J=9.1Hz)，6.88(d，J=9.4Hz)，6.41(s)，6.18(s).紫云英苷:δ8.04(d，J=7.4Hz，)，6.88(d，J=7.7Hz)，6.43(s)，6.21(s). 綠原酸甲酯 δ7.54(d，J=15.6Hz)，7.16(s)，7.05(d，J=7.2)，6.88(d，J=7.2Hz)，6.25(d，J=15.6Hz). 陸地錦苷 δ8.05(s)，7.97(s)，7.58(d，J=8.5Hz)，6.96(d，J=8.4Hz)，6.51(s)山萘酚 δ8.16(d，J=8.9Hz)，7.02(d，J=8.9Hz)，6.53(d，J=1.7Hz)，6.27(d，J=1.8Hz)。

圖2 杜仲葉總體取物1H-NMR譜Fig.2 The1H-NMR spectrum of crude extracts of Eucommia ulmoides Leaves

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5次重復(fù)提取的相關(guān)系數(shù)值分別為0.993，0.994，0.993，0.996，1，均在 0.99 以上，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本研究采用1H-NMR分析技術(shù)，全面地體現(xiàn)了黔產(chǎn)杜仲葉的化學(xué)成分，同時(shí)使用了核磁滴定和JRES二維核磁共振波譜技術(shù)，對杜仲葉中的特征化合物進(jìn)行了歸屬。研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的高效液相色譜方法相比，基于核磁共振的分析技術(shù)能提供更全面的信息。同時(shí)選用cpmgt2脈沖序列測試1H-NMR譜，能很好的過濾掉杜仲膠等大分子信號，簡化譜圖。本方法樣品制備簡單、分析速度快，所建立的1H-NMR指紋圖譜重現(xiàn)性好，這為杜仲葉質(zhì)量控制提供了一種新方法。

［1］辛?xí)悦鳎T 蕾，王 浩，等.杜仲的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(19):1 057-1 059.

［2］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.第35(2)卷.北京:科學(xué)出版社，1979:116.

［3］趙軍太，張 誠.杜仲的不同部位的化學(xué)成分研究與應(yīng)用［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2003，10(9):1 025-1 026.

［4］管淑玉，蘇薇薇.杜仲化學(xué)成分與藥理研究進(jìn)展［J］.中藥材，2003，26(2):124-129.

［5］寧康健，鄭淑紅，呂錦芳，等.杜仲葉水提醇沉液降壓作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2009，16(4):283-285.

［6］邱 果，包 旭，李 穎，等.杜仲葉醇提取物對小鼠免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2008，24(4):41-43.

［7］楊 津，董文賓，許先猛，等.杜仲葉黃酮苷抗疲勞和抗氧化活性的研究［J］.陜西大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，28(3):60-63.

［8］董 芬，范田運(yùn)，張建新，等.杜仲葉的化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26(5):679-682.

［9］王龍星，肖紅斌，梁鑫淼，等.一種評價(jià)中藥色譜指紋譜相似性的新方法:向量夾角法［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(9):713-717.

［10］苗愛東，孫殿甲.Excel 2002在中藥指紋譜相似度計(jì)算中的應(yīng)用［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2003，27(1):51-54.