楨楠多胚現(xiàn)象與多胚苗形態(tài)發(fā)育的研究

余道平，彭啟新，胡庭興，謝孔平，李小杰

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川成都 610041;2.四川省生物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實驗室，四川成都 610041;3.峨眉山生物資源實驗站，四川峨眉山 614201;4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川雅安 625000)

楨楠(Phoebe zhennan)為樟科(Lauraceae)楠屬(Phoebe Nees)高大喬木，產(chǎn)于四川、陜西、云南等省。野生海拔1 100 m以下，分布區(qū)位于亞熱帶常綠闊葉林區(qū)西部，四川、湖北西部和貴州西部都有分布。楨楠是我國二級保護(hù)樹種，樹干高大、通直、挺拔，樹冠濃蔭，四季常青，常見于風(fēng)景名勝區(qū)、寺廟等。在園林上常作為庭蔭樹或行道樹，為我國著名的觀賞樹種之一。在植物的一個胚珠中包含兩個或兩個以上種胚的現(xiàn)象稱為多胚現(xiàn)象［1］。楨楠的多胚現(xiàn)象已有部分報道［2，3］，但對楨楠多胚的形態(tài)特征和多胚著生位置等研究報道不多。本研究觀察了楨楠多胚種子的形態(tài)特征及多胚苗的生長情況，觀察了多胚苗體細(xì)胞染色體數(shù)目，旨在了解楨楠多胚形態(tài)特征和多胚苗的生長發(fā)育情況，并探討其遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

楨楠種子于2013年11月初采自峨眉山海拔1 000 m分布區(qū)，種子經(jīng)揉撮除去外種皮，沖洗干凈后用濕沙儲藏備用。

1.2 方法

1.2.1 多胚形態(tài)及其發(fā)育觀察

2014年3月將楨楠種子沿著種縫掰開，觀察多胚種子中胚的形態(tài)與著生位置，并統(tǒng)計多胚率。將種子播于穴盤中培養(yǎng)，觀察多胚苗的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。

1.2.2 多胚苗體細(xì)胞染色體數(shù)目鑒定

切取單胚種子和多胚種子萌發(fā)的幼嫩根尖為材料，用0.002 mol·L-18-羥基哇琳預(yù)處理 5 h，4℃冰箱中卡諾固定液固定20 h，在1 mol·L-1鹽酸中(水浴60℃)溶液解離7 min～8 min，取出用水漂洗，切取根尖置于載玻片上，改良品紅染液染色，過一下酒精燈(充分著色)放置約10 min，壓蓋玻片，敲片，于100倍油鏡下觀察30個細(xì)胞，統(tǒng)計染色體數(shù)目并拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 多胚現(xiàn)象觀察結(jié)果

通過對450粒楨楠種子的觀察，多胚種子數(shù)共56粒，多胚率為12.4%。多胚種子胚數(shù)有2胚、3胚、4胚，依胚數(shù)可把楨楠多胚種子分為雙胚型、3胚型、4胚型。其中雙胚出現(xiàn)的頻率較高，占9.0%，3胚率為2.4%，4胚率0.6%。

2.2 胚的形態(tài)與著生位置

楨楠多胚種子在外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上與單胚種子有些差別，多胚種子外形不規(guī)整，有凸起，且2-4瓣。單胚種子的胚著生在種子的底部，子葉朝向種子頂部，胚具有發(fā)育完整的子葉和胚軸。本研究發(fā)現(xiàn)楨楠種子多胚的形態(tài)及其著生部位存在多樣性，如圖2所示。從多胚種子中切取胚進(jìn)行胚形態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)胚有大胚和小胚之分，大胚的形態(tài)大小和生長發(fā)育狀況與單胚種子的胚一致，胚發(fā)育正常;小胚個體小，有些發(fā)育完整，有胚軸和子葉，一些發(fā)育不完整。對胚的著生位置觀察后發(fā)現(xiàn)，單胚種子的胚一般著生在種子的底部，而多胚種子的胚可出現(xiàn)在種子的底部、頂部、中部和中部的兩側(cè);雙胚有緊靠著的，有分開的。依多胚在種子內(nèi)的著生位置可將雙胚種子初步劃分為3種類型:(1)雙胚緊靠著生在種子底部(圖2-B，E)，(2)雙胚緊靠著生在種子中部的兩側(cè)(圖1-F，G);(3)雙胚分離著生(一胚在種子底部，一胚在種子中部或頂部)(圖1-C，D，H)。3胚種子一般分離著生，一胚著生在種子底部，另兩胚在種子中上部(圖1-I，J，K)。4胚種子中的大胚著生在種子底部，其他3胚分離著生在種子中部或頂部(圖1-L)。

圖1 楨楠多胚形態(tài)和位置示意圖Fig.1 The shape and position of polyembryony in Phoebe zhennan seeds

2.3 多胚再生植株的生長發(fā)育狀況

多胚種子在穴盤里培養(yǎng)20 d后開始發(fā)芽，經(jīng)40 d的生長發(fā)育，發(fā)現(xiàn)多胚苗在長勢，個體大小，根、莖、葉器官發(fā)育等性狀上各異;多胚苗存在大、小株，同株的比率少，多胚植株均具有自己獨(dú)立的根和莖，在所觀察的幼苗中，未發(fā)現(xiàn)多胚苗連體或無胚軸或無根等現(xiàn)象。雙胚植株的形態(tài)可歸納為兩種類型:(1)雙同株，即兩植株大小、長勢相同、生長發(fā)育正常(圖2-A);(2)大小株，即兩植株生長發(fā)育正常、但一株長勢正常另一株長勢稍弱(圖2-B)。在3胚和4胚再生植株中，可見1～2個植株生長正常，其余的長勢較弱(圖2-C)。

圖2 多胚植株發(fā)育狀況Fig.2 Developmental status of polyembryonic seedlings

2.4 多胚植株體細(xì)胞染色體數(shù)目鑒定結(jié)果

對楨楠單胚植株、多胚植株進(jìn)行體細(xì)胞染色體數(shù)目鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的體細(xì)胞染色體數(shù)目相同，均為二倍體(2n=24)(圖3)，未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常的情況，說明楨楠多胚植株是二倍體植株。

圖3 楨楠多胚苗體細(xì)胞染色體Fig.3 Somatic chromosomes of Phoebe zhennan polyembryonic seedlings(2n=24)

3 結(jié)論與討論

由1粒多胚種子可以同時萌發(fā)出兩株或兩株以上的幼苗，這種一籽多苗稱之為多胚苗［4］。有許多研究表明植物的多胚現(xiàn)象與其無融合生殖現(xiàn)象具有一定的相關(guān)性。因此許多學(xué)者試圖尋找多胚苗材料，進(jìn)而從中篩選出具有無融合生殖特性的基因資源［5～6］。本試驗是通過解剖、觀察胚的形態(tài)來判斷楨楠的單胚、多胚比率和胚著生位置的，這與張蕾［7］的研究方法較為一致，而黃宇［8］、莫饒等［9］是依據(jù)多胚苗形成情況來判定的。本研究發(fā)現(xiàn)楨楠多胚率為12.4%，多胚在種子內(nèi)的位置不定，且形成的多胚苗的生長發(fā)育也有差異。對于楨楠多胚的形成是否為無融合生殖還有待于進(jìn)一步弄清其胚胎發(fā)育特性，以及多胚發(fā)生頻率是否與其遺傳基因、環(huán)境因子有關(guān)，都還有待于進(jìn)一步研究，這將對其開展育種工作具有重大意義。

本研究還對楨楠單胚苗、多胚苗的體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單胚苗、多胚苗均為二倍體材料(2n=24)，這與莫饒等［10］在芒果多胚研究中的結(jié)果一致。為了了解多胚種子后代在遺傳基因上的關(guān)系，還需進(jìn)一步開展其染色體核型分析、SSR標(biāo)記等研究。

［1］黃群策，孫敬三.被子植物多胚苗的研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)通報，1998，15(2):1～7.

［2］余道平，彭啟新，李小杰，等.細(xì)葉楠穴盤育苗技術(shù)［J］.林業(yè)實用技術(shù)，2012(12):39～40.

［3］舒金枝.楨楠容器育苗［J］.廣西林業(yè)科學(xué)，2009，38(3):45～46.

［4］馮輝，翟玉瑩.韭菜多胚苗及其與無融合生殖關(guān)系的研究［J］.園藝學(xué)報，2007，34(1):225～226.

［5］馮輝，趙鐘志.韭菜無融合生殖的遺傳特性及其與多胚性關(guān)系的研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41(3):270～274.

［6］張斯淇，徐強(qiáng)，鄧秀新.無融合生殖與柑橘多胚現(xiàn)象的研究進(jìn)展［J］.植物科學(xué)學(xué)報，2014，32(1):88～96.

［7］張蕾，葛鈞.平邑甜茶多胚現(xiàn)象研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14(21):61～62.

［8］黃宇.閩楠種子萌發(fā)與多胚苗研究［J］.福建林業(yè)科技，2014，41(3):27～31.

［9］莫饒 ，鄭成木，朱穩(wěn)，等.咖啡多胚現(xiàn)象與多胚苗形態(tài)發(fā)育的研究［J］.植物學(xué)通報，2004，21(2):189～194.

［10］莫饒，羅遠(yuǎn)華，周世民，等.幾個芒果品種的胚性及多胚苗遺傳分析［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2005，3(6):475～479.