不同心功能糖尿病心肌病大鼠瞬時外向鉀電流的變化及意義

劉星，張良勝，楊錦龍，陳俞瑾，諸波，査克嵐，楊悠，范忠才

（1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000;2永城市人民醫(yī)院）

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，其發(fā)病率高，常伴發(fā)多種心律失常，是導(dǎo)致患者心力衰竭和死亡的主要原因［1，2］。心律失常的發(fā)生除與基礎(chǔ)疾病造成的心臟結(jié)構(gòu)改變（即結(jié)構(gòu)重構(gòu)）外，還和電流通道改變（即電重構(gòu)）有密切關(guān)系。就單個心肌細胞而言，瞬時外向鉀電流（Ito）是參與細胞1期復(fù)極及平臺期形成的主要離子流，對動作電位不應(yīng)期的形成及維持其穩(wěn)定性起著重要作用。當(dāng)Ito發(fā)生改變時，必將導(dǎo)致心肌細胞動作電位變化，從而可能引起心律失常。2012年12月～2013年11月，本研究通過比較不同心功能DCM大鼠心肌細胞Ito的變化，進而探討在不同病理狀態(tài)下其離子通道變化情況以及心律失?？赡艿陌l(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:清潔級SD成年大鼠30只，均為雄性，體質(zhì)量180～220 g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。主要試劑:復(fù)合麻醉劑、膠原酶Ⅱ、乙二醇雙四乙酸、羥乙基哌嗪乙磺酸、鏈脲佐菌素（STZ），均為Sigma公司產(chǎn)品。主要儀器:動物呼吸機（江西特力呼吸機設(shè)備公司），GE Vivid7.0心臟超聲心動儀（美國GE），膜片鉗放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan），A/D轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA），三維操縱器（WN 203，Narishige，Japan），電極經(jīng)橫式拉制機（P-97 sutter，USA），Langendorff灌流裝置（ML176，Austrilia）等。

1.2 動物分組及DCM、DCM心衰模型的建立 30只大鼠隨機分成3組:對照組（n=10）、DCM組（n=10）、DCM心衰組（n=10）。對照組始終以普通飼料喂養(yǎng)，DCM組及DCM心衰組均以高脂飲食喂養(yǎng)。DCM組:10只SD大鼠，喂養(yǎng)至第6周以1%STZ 30 mg/kg腹腔注射，對照組以同體積檸檬酸緩沖液一次性腹腔注射。72 h后尾靜脈取血測血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L判斷為2型糖尿病造模成功。造模成功后繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周。DCM心衰組:10只SD大鼠按照上述方法制作成DCM大鼠，于注射STZ后第3周進行左冠狀動脈結(jié)扎術(shù):用復(fù)合麻醉劑進行腹腔注射麻醉，氣管插管，設(shè)定呼吸機參數(shù)（呼吸頻率90次/min，呼吸比1∶1，潮氣量10～12 mL）。胸骨左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐之間用5-0絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，觀察左室前壁心肌顏色變蒼白，搏動減弱時關(guān)閉胸腔。大鼠自主呼吸恢復(fù)后拔除氣管插管。術(shù)后傷口定期換藥，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)至術(shù)后第3周。同時選擇對照組大鼠進行假手術(shù)，實驗步驟與前相同但不結(jié)扎左冠狀動脈。

1.3 心功能的測定 DCM組和DCM心衰組分別于結(jié)扎術(shù)后第3周，采用GE Vivid7.0心臟超聲心動儀12S探頭，經(jīng)大鼠胸骨左心長軸乳頭肌切面分別測量:左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESD），每次測量3個心動周期后取平均值。并根據(jù)Teichholtz矯正公式計算出左室射血分數(shù)（LVEF）、左室內(nèi)徑縮短率（LVFS）。

1.4 病理學(xué)變化的觀察 隨機抽取對照組、DCM組及DCM心衰組各3只大鼠左心室進行連續(xù)切片，然后HE染色、顯微鏡下觀察并拍照記錄病理變化。

1.5 心肌細胞的分離 將無鈣臺液、KB液和酶液分別用95%O2和5%CO2飽和30 min，打開與Langendorff相連的恒溫浴槽。用去離子水沖洗Langendorff系統(tǒng)10 min。將3%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g、肝素4 U/g注入SD大鼠腹腔。麻醉成功后，剪開大鼠胸腔，迅速取出心臟后置于4℃無鈣臺液中，經(jīng)主動脈逆行插管，固定于Langendorff灌流裝置上。先用無鈣臺液沖凈殘存在冠狀動脈和心室中的血液，換成消化酶液，以8 mL/min持續(xù)灌流6～7 min，然后每隔1 min剪取一小塊左心室組織，共10次，依次裝于盛有KB液的10個小瓶中。將取下的心肌組織塊剪碎，用吸管輕輕吹打，再用200目篩網(wǎng)過濾，得到細胞混懸液，置于氧飽和的KB液保存，室溫下1 h后置于4℃冰箱中備用。

1.6 Ito電流密度的測定 取急性酶分離的大鼠心肌細胞，采用全細胞膜片鉗記錄模式記錄電流。選擇細胞膜光滑完整、橫紋清楚、無收縮的細胞，制作形成細胞貼附式膜片，在此基礎(chǔ)上，向微電極內(nèi)給予較強的負壓形成全細胞記錄構(gòu)型。最后施以Ito刺激方案，保持電位于-80 mV下，以10 mV為階躍，自-50 mV去極化至+70 mV，鉗制時間為300 ms引導(dǎo)出Ito刺激波形。使用膜片鉗放大器記錄電流信號，經(jīng) A/D轉(zhuǎn)換器處理后，用 Clampex（version 10.1）軟件系統(tǒng)采集后儲存于計算機中。采樣頻率為10 kHz，采樣方式為Clampex下的Episodic stimulation［3］。電流密度 = 電流強度（I）/膜電容（c）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果以±s表示，3組比較采用單因素方差分析、組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較 見表1。

2.2 各組心肌病理切片觀察結(jié)果 對照組心肌纖維排列整齊，可見橫紋，胞質(zhì)豐富，細胞間隙正常。DCM組及DCM心衰組心肌細胞排列紊亂、扭曲、部分斷裂，纖維化明顯，符合DCM心肌病理變化，其中尤以DCM心衰組大鼠表現(xiàn)顯著。

表1 各組 LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 比較（±s）

表1 各組 LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 比較（±s）

注:與對照組比較，﹟ P ＜0.05;與 DCM組比較，▲P ＜0.05。

組別 n LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）對照組 10 5.72±0.45 4.07±0.35 61.62 ±4.34 32.12±3.82 DCM 組 10 5.76±0.48 4.09±0.47 61.37 ±5.85 31.85±4.13 DCM 心衰組 10 7.82±0.46﹟▲ 6.74±0.52﹟▲ 44.86±4.25﹟▲ 19.29±3.98﹟▲F 67.86 114.99 38.88 33.93 P 0.00 0.00 0.00 0.00

2.3 各組左心室心肌細胞Ito變化 施以Ito電流刺激方案后，引導(dǎo)出各實驗組Ito電流圖（圖1）。各組Ito的電流密度比較見表2。各組I-V曲線見圖2。3組的I-V曲線均呈線性依賴性，為內(nèi)向整流特性，從指令電壓-50 mV至-20 mV，電流幅度增加不明顯，3組曲線走向均平緩。從指令電壓-20 mV至+70 mV，對照組電流增幅較大，而 DCM組及DCM心衰組增幅較小，兩者均較對照組明顯下移，尤其是在指令電壓+10 mV以后更為明顯，且以DCM心衰組下移顯著。見圖2。

圖1 各組Ito電流圖及Ito刺激方案

圖2 各組I-V曲線圖

3 討論

DCM是以心肌代謝紊亂為特征的特異性心肌疾病，其發(fā)病率高，是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥［1，2］。DCM 早期主要表現(xiàn)為舒張功能降低，晚期以收縮功能障礙為主，而隨著心功能的變化其心律失常概率也明顯增加，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因［4，5］。一方面，心功能下降使心臟極易發(fā)生各種心律失常［6］。另一方面，糖尿病本身是多種心律失常的致病因子或高危因素，如房顫、室性心律失常等［7，8］。但DCM發(fā)病的具體機制目前并不完全清楚。心律失常的發(fā)生與心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)有密切關(guān)系。因此，推測DCM心律失常的發(fā)生除與其代謝紊亂造成的心肌結(jié)構(gòu)變化外，可能還與離子流及其通道的改變有關(guān)。單個心肌細胞存在多種離子通道，其正常分布和離子流規(guī)則活動是維持心肌細胞正常電活動的基礎(chǔ)。其中，K+直接參與心肌電興奮的恢復(fù)過程，對心肌動作電位時程（APD）的長短具有決定性作用，故K+濃度及K+通道的變化是導(dǎo)致嚴(yán)重心律失常的重要因素。Ito是主要的外向性K+流，在心肌動作電位0相時被激活，參與了動作電位1相復(fù)極過程，并對動作電位2相的起始水平起決定性作用;調(diào)節(jié)L-Ca2+通道及Na+-Ca2+交換的活性，從而對APD有明顯影響［9］。有研究認為，單純Ito減小使動作電位平臺起點較高（位于正電壓水平），導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流電-化學(xué)驅(qū)動力下降，Ca2+內(nèi)流減小、復(fù)極加快進而使APD縮短，可引發(fā)各種心律失常［10］。因此，研究Ito在電重構(gòu)中的作用有重要意義。

表2 各組Ito的電流密度比較（n=10，pA/pF，±s）

表2 各組Ito的電流密度比較（n=10，pA/pF，±s）

注:與對照組比較，*P ＜0.05。

測試電壓（mV） 對照組 DCM組 DCM心衰組-50 0.05 ±0.02 0.13 ±0.01 0.14 ±0.12-40 0.06 ±0.04 0.17 ±0.31 0.20 ±0.03-30 0.49 ±0.40 0.86 ±0.82 1.02 ±1.02-20 1.91 ±0.83 1.98 ±0.14 2.07 ±2.33-10 4.35 ±2.01 3.61 ±2.45 3.39 ±3.35 0 6.92 ±2.80 4.62 ±4.05 4.09 ±4.05+10 8.90 ±3.20 6.10 ±5.31 5.28 ±5.06+20 12.50 ±4.00 7.21 ±5.30 6.49 ±6.02+30 17.07 ±4.52 10.12 ±6.30 7.92 ±7.03+40 24.15 ±4.72 11.40 ±6.85 9.05 ±7.35+50 27.90 ±5.02 13.74 ±7.12 10.83 ±8.01+60 32.11 ±4.52 15.31 ±8.71 12.05 ±9.02*+70 38.65 ±5.05 17.70 ±9.21* 15.22 ±9.13*

本研究主要證實了DCM大鼠心室肌細胞存在Ito電流密度的變化，并且隨著心功能的下降其變化更加明顯。首先，對比DCM組和對照組:當(dāng)電壓為+70 mV時，DCM組的Ito電流密度較對照組明顯降低，I-V曲線也較對照組下移明顯。結(jié)合分析大鼠周齡及心臟功能變化，說明在出現(xiàn)收縮功能障礙前即DCM大鼠僅有舒張功能下降時就出現(xiàn)了Ito的減弱，這可能是DCM發(fā)生心律失常的早期離子基礎(chǔ)。其次，對比DCM心衰組和對照組:當(dāng)電壓為+60 mV時，DCM心衰組的電流密度就比對照組明顯降低，這比DCM組出現(xiàn)要早，從I-V曲線看，DCM心衰組較對照組下移更加明顯。結(jié)合心功能變化，說明當(dāng)DCM大鼠出現(xiàn)收縮功能障礙時，Ito的變化更加顯著，這可能是DCM晚期極易發(fā)生心律失常的原因之一。雖然DCM組和DCM心衰組在Ito電流密度的變化上沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但通過分析I-V曲線變化的趨勢以及與對照組對比其變化的時間早晚，我們認為DCM心衰組有變化更為顯著的趨勢，這說明隨著DCM心功能的改變其Ito亦隨之變化，推測改善心功能可有助于穩(wěn)定其Ito。

總之，DCM除因代謝紊亂造成的心肌結(jié)構(gòu)的改變，其還存在電活動的改變，尤其當(dāng)心功能下降時這種改變更加顯著，這些變化共同組成了DCM心律失常的基礎(chǔ)，其中Ito扮演著重要角色。對DCM電重構(gòu)的深入研究將有助于闡明其心律失常的機制，并有助于尋找特異性的治療方案。

［1］Boudina S，Abel ED.Diabetic cardiomyopathy revisited［J］.Circulation，2007，115（25）:3213-3223.

［2］Cai L，Kang YJ.Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy:a brief review［J］.Cardiovasc Toxicol，2001，1（3）:181-193.

［3］劉振偉.實用膜片鉗技術(shù)［M］.北京:軍事科技出版社，2006:90-103.

［4］van Melle JP，Bot M，de Jonge P，et al.Diabetes，glycemic control，and new-onset heart failure in patients with stable coronary artery disease:data from the heart and soul study［J］.Diabetes Care，2010，33（9）:2084-2089.

［5］Fagher K，L?ndahl M.The impact of metabolic control and QTc prolongation on all-cause mortality in patients with type 2 diabetes and foot ulcers［J］.Diabetologia，2013，56（5）:1140-1147.

［6］Cai C，Hua W，Ding LG，et al.High sensitivity C-reactive protein and cardfiac resynchronization therapy in patients with advanced heart failure［J］.J Geriatr Cardiol，2014，11（4）:296-302.

［7］Nichols GA，Reinier K，Chugh SS.Idependent contribution of diabetes to increased prevalence and incidence of atrial fibrillation［J］.Diabetes Care，2009，32（10）:1851-1856.

［8］Huxley RR，Alonso A，Lopez FL，et al.Type 2 diabetes，glucose homeostasis and incident atrial fibrillation:the Atherosclerosis Risk in Communities Study［J］.Heart，2012，98（2）:133-138.

［9］Grant AO.Cardiac ion channels［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2（2）:185-194.

［10］Tomita F，Bassett AL，Myerburg RJ，et al.Diminished transient outward currents in rat hypertrophied ventricular myocytes［J］.Circ Res，1994，75（2）:296-303.