普蘭林肽的合成新方法

楊曉婧，趙紅玲，尹志峰，王良友，張森，寇成

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000

2.河北威遠動物藥業(yè)有限公司，河北石家莊050011 3.河北民族師范學(xué)院，河北承德067000）

普蘭林肽的合成新方法

楊曉婧1，趙紅玲1，尹志峰1，王良友1，張森2，寇成3*

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000

2.河北威遠動物藥業(yè)有限公司，河北石家莊050011 3.河北民族師范學(xué)院，河北承德067000）

首先，通過合理的分析，將普蘭林肽長鏈分割為7個短肽鏈。以Fmoc氨基酸為起始原料，首先通過液相合成法，合成7個短肽鏈化合物。然后采用Fmoc固相合成法，以Amide Rink MBHA樹脂做載體，以HBTU/HOBt/DIEA做縮合劑，逐步縮合得到全保護線性普蘭林肽樹脂。用碘氧化半胱氨酸的巰基形成二硫鍵。以TFA的混合溶劑裂解脫除保護基團得到粗品。最后，通過反相制備液相純化得到98%以上的普蘭林肽產(chǎn)品。該工藝總收率為37%。液相固相組合合成的方法操作簡單，效率高，成本低，收率高，產(chǎn)品純度高，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

普蘭林肽；液相合成法；固相合成法；二巰鍵

普蘭林肽(Pramlintide)是胰淀粉樣多肽的一種合成類似物，最早由美國Amylin Pharmaceuticals公司研制，于2005年3月16號獲得美國FDA批準，適用于使用胰島素但無法達到預(yù)期療效的I型和II型糖尿病患者的輔助治療，也是至今為止繼胰島素之后第二個獲準用于治療I型糖尿病的藥物。胰淀粉樣多肽是一種由37個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽激素，具有穩(wěn)定的調(diào)節(jié)人體血糖作用[1]。普蘭林肽與胰淀粉樣多肽的氨基酸序列差異表現(xiàn)在前者第25位(丙氨酸)、28位(絲氨酸)和29位(絲氨酸)由脯氨酸所替代[2]。研究證實，普蘭林肽具有降低糖尿病患者體內(nèi)血糖波動頻率和波動幅度，改普總體血糖控制的作用。其氨基酸序列見圖1[3]。

圖1　普蘭林肽氨基酸序列圖

本實驗采用液相和固相組合的方法制備普蘭林肽，優(yōu)化了合成工藝，縮短了實驗周期，降低了實驗成本，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

1　實驗部分

1.1主要試劑與儀器

Alltech PH426型反相高效液相色譜儀（UV檢測器，美國Alltech公司）；Newstyle型反相高效制備液相色譜儀（蘇州漢邦科技有限公司）；Heal Force系列純水機（香港力康公司）；CHRIST凍干機（北京博勵行儀器有限公司）；高速大容量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；752型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；AR224CN型分析天平（美國奧豪斯儀器上海有限公司）。

Amide Rink MBHA樹脂（0.41mmol/g（美國多肽科技有限公司）；Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、NH2-Ala-OAllyl、NH2-Arg(Pbf) -OAllyl、NH2-Asn(Trt)-OAllyl、Fmoc-Leu-OH、NH2-Leu-OAllyl、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、NH2-Val-OAllyl、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、NH2-Tyr(tBu)-OAllyl、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鹽（PyBOP）、1-羥基苯駢三唑（HOBt）、三氟醋酸（TFA）、N,N-二異丙基乙胺（DIEA）均購自上海吉爾生化有限公司；二氯甲烷（DCM）、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、苯甲硫醚、苯酚、三異丙基硅烷（TIS）、乙二硫醇（EDT）、茚三酮、哌啶、碘、正己烷均為市售分析純；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chenmical）；純化水（自制）。

1.2實驗步驟

1.2.1Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-OAllyl肽鏈的液相合成[5]Fmoc-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-OAllyl的合成

反應(yīng)瓶中加入600mL DCM、150mL DMF和8.32g（30mmol）NH2-Tyr(tBu)-OAllyl。室溫攪拌至溶解澄清后，加入13.12g（33mmol）Fmoc-Thr(tBu)-OH、12.37g（1.1當量）HBTU，再加入DIEA調(diào)Ph值為8左右，室溫反應(yīng)。反應(yīng)3 h，薄層板色譜檢測NH2-Tyr(tBu)-OAllyl對應(yīng)點消失，反應(yīng)結(jié)束。旋蒸除去DCM，將反應(yīng)液緩慢倒入攪拌狀態(tài)的1000mL冷水中，析出白色絮狀固體，抽濾，冷水洗滌2次，干燥，得Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品19.3g，收率98.2%。

Fmoc-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl的合成

反應(yīng)瓶中加入300mL DCM、19.3g Fmoc-Thr (tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品，攪拌狀態(tài)下，緩慢加入100mL二乙胺。溶解澄清后，室溫攪拌2h，旋蒸至干，正己烷洗滌（50mL×3），得NH2-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-OAllyl。

上述反應(yīng)瓶中加入600mL DCM、150mL DMF，攪拌溶解，加入19.3g（1.1當量）Fmoc-Asn(Trt)-OH，12.15g（1.1當量）HBTU，再加入DIEA調(diào)Ph值為8左右，室溫反應(yīng)。反應(yīng)3 h，薄層板色譜檢測NH2-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl對應(yīng)點消失，反應(yīng)結(jié)束。旋蒸除去DCM，將反應(yīng)液緩慢倒入攪拌狀態(tài)的1000mL冷水中，析出淺黃色固體，抽濾，冷水洗滌2次，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品28.4g，收率95.0%。

Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl的合成

反應(yīng)瓶中加入300mL DCM、28.3g Fmoc-Asn (Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品，攪拌狀態(tài)下，緩慢加入100 mL二乙胺。溶解澄清后，室溫攪拌2h，旋蒸至干，正己烷洗滌（50mL×3），得NH2-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl。

上述反應(yīng)瓶中加入600mL DCM、150mL DMF，攪拌溶解，加入11.8g（1.1當量）Fmoc--Ser(tBu)-OH，11.53g（1.1當量）HBTU，再加入DIEA調(diào)Ph值為8左右，室溫反應(yīng)。反應(yīng)5h，薄層板色譜檢測NH2-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl對應(yīng)點消失，反應(yīng)結(jié)束。旋蒸除去DCM，將反應(yīng)液緩慢倒入攪拌狀態(tài)的1000mL冷水中，析出類白色絮狀固體，抽濾，冷水洗滌2次，干燥，得Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品31.1g，收率96.3%。

Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl的合成

反應(yīng)瓶中加入300mL DCM、31.1g Fmoc-Ser (tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品，攪拌狀態(tài)下，緩慢加入100 mL二乙胺。溶解澄清后，室溫攪拌2h，旋蒸至干，正己烷洗滌（50mL×3），得NH2-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl。

上述反應(yīng)瓶中加入600mL DCM、150mL DMF，攪拌溶解，加入8.3 g（1.1當量）Fmoc-Gly-OH，10.13g（1.1當量）HBTU，再加入DIEA調(diào)Ph值為8左右，室溫反應(yīng)。反應(yīng)5 h，薄層板色譜檢測NH2-Ser (tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl對應(yīng)點消失，反應(yīng)結(jié)束。旋蒸除去DCM，將反應(yīng)液緩慢倒入攪拌狀態(tài)的1000mL冷水中，析出類白色絮狀固體，抽濾，冷水洗滌2次，干燥，得Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn (Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl產(chǎn)品28.4g，收率93.4%。

Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl脫除烯丙基保護

反應(yīng)瓶中加入450mL DCM、13mLN-甲基嗎啉和26.9g Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-OAllyl，攪拌至溶解澄清，加入8.3g（4當量）(PPh3)4Pd。抽真空，通氮氣，室溫反應(yīng)8h，直至薄層板色譜檢測Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl對應(yīng)點消失，反應(yīng)結(jié)束。旋蒸至干，加入適量DMF攪拌溶解。溶解液緩慢加至冷水中，析出類白色固體，抽濾，冷水洗滌2次，正己烷洗滌2次，干燥。得Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu) -Tyr(tBu)-OH產(chǎn)品27.7g，收率98.7%，純度為84.9%。

小結(jié)：

Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-OAllyl肽鏈液相合成的總收率為82.8%。能夠滿足進行下步操作的要求，故沒有進行單獨的精制操作。由于其肽鏈中存在較為活潑的官能團，分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，空間位阻大，對最終產(chǎn)品的合成影響較大，故對其進行了MALDI-TOF-MS檢測，經(jīng)MALDITOF-MS分析，測的峰值為[M-1]m/z 1212.2436，確定自制品的相對分子質(zhì)量為1213，與理論值1212.61一致。

1.2.2其他鏈肽的液相合成

Fmoc-Pro-Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-OH、Fmoc-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-OH、

Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-OH、

Fmoc-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-OH、

Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-OH、

Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ala-OH鏈肽均按照1.2.1的方法進行偶聯(lián)合成。

其中Fmoc-Pro-Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-OH產(chǎn)品收率93.1%，純度88.7%；Fmoc-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-OH產(chǎn)品收率93.4%，純度89.3%；Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-OH產(chǎn)品收率86.0%，純度85.0%；Fmoc-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-OH產(chǎn)品收率90.0%，純度85.5%；Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Thr(tBu)-Gln (Trt)-Arg(Pbf)-OH產(chǎn)品收率88.1%，純度83.3%；Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ala-OH產(chǎn)品收率89.5%，純度88.0%。

由于肽鏈Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-OH肽鏈較長，涉及的氨基酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，空間位阻大，對最終產(chǎn)品的合成影響較大，所以對其也分別進行了MALDI-TOF-MS檢測，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，測的峰值為[M-1] m/z分別為1732.1253、1748.0210，確定短鏈產(chǎn)品的相對分子質(zhì)量為1733、1749與理論值1732.84、1748.81一致。

1.2.3固相合成步驟

樹脂的溶脹[6]

將60.0g Fmoc-RinkAmide MBHA resin加入到500mL反應(yīng)柱中，加入300mLDMF混合1h，使樹脂充分溶脹。加入DCM洗滌（100mL×3），再加入DMF洗滌（100mL×3）。

樹脂脫除Fmoc保護基

向玻璃反應(yīng)柱內(nèi)加入配制好的30%哌啶/DMF溶液300mL，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng)液，加入DMF洗滌（100mL×3）。

肽鏈的偶聯(lián)反應(yīng)

稱取Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-OH14.43g及HBTU5.61g、HOBt2.0g、DIEA4.18mL，加入DMF 120mL攪拌溶解，攪拌均勻后加入到玻璃反應(yīng)柱內(nèi)，攪拌反應(yīng)。用茚三酮顯色反應(yīng)檢測進程，確定偶聯(lián)時間，直至反應(yīng)完成。

肽鏈的延長

反應(yīng)完畢后，抽去反應(yīng)液，用DMF洗滌（100mL×3），加入配制好的30%哌啶/DMF溶液300mL，攪拌反應(yīng)30min，抽除反應(yīng)液，加入DMF洗滌（100mL×3），即可按照上述偶聯(lián)方法依次進行Fmoc-Pro-Pro-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-OH、Fmoc-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-OH、

Fmoc-Val-His(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Asn(Trt)-OH、

Fmoc-Leu-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-OH、

Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-OH和

Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ala-OH的偶聯(lián)反應(yīng)，直至37個氨基酸偶聯(lián)完成，得到普蘭林肽。

普蘭林肽的氧化

稱取普蘭林肽樹脂肽120g，加入含0.05mol/L碘的DMF溶液1000mL，室溫攪拌反應(yīng)4小時。反應(yīng)完畢，減壓蒸餾，除去溶劑，然后再加入甲醇200mL，減壓蒸干，重復(fù)三次。加100mL甲醇后用DMF洗滌（200mL/次），直至樹脂恢復(fù)淺黃色，再用DCM洗滌（200mL×3），最后甲醇洗滌樹脂得到全保護的普蘭林肽-氨基樹脂。

普蘭林肽的裂解

稱取干燥后的全保護的普蘭林肽-氨基樹脂100g至圓底燒瓶中，加入TFA/苯甲硫醚/苯酚/水/ EDT/TIS=85/5/5/4/1(體積比)混合液[4]300mL，冰浴反應(yīng)2h。過濾，將母液濃縮至粘稠狀，倒入冷凍的乙醚中，析出無色固體，離心機（3000rpm）分離粗肽，棄去上清液，固體用乙醚洗滌3次。得粗肽46.2g，收率95.1%，純度為90.5%。

1.2.4粗品普蘭林肽的純化[3]

將20mg粗品普蘭林肽固體溶于5mL超純水中，用Newstyle型反相高效制備液相色譜儀分離純化。條件如下：色譜柱OBD C18柱（1.9mm×150mm，10μm）；流速：10mL/min；梯度洗脫A：0.05%TFA溶液，B：0.05TFA乙腈溶液（0-100%），洗脫，收集主峰，旋蒸，凍干，得普蘭林肽純品17.8mg，純度為98.1%，總收率為37.0%。

1.2.5結(jié)構(gòu)鑒定

高效液相色譜對比

取自制樣品，與所購標準品進行HPLC保留時間對比。色譜柱為Accurasil C18柱（250mm×4.6mm，5μL）；流動相為A：0.05%TFA/水溶液，B：0.05%TFA/乙腈溶液（5%-95%），梯度洗脫30min，流速1mL/ min，檢測波長為215nm，樣品濃度1mg/mL，進樣量15μL。自制樣品和標準品保留時間分別為15.851min和15.849min，確定產(chǎn)品為目標產(chǎn)物。見圖2。

MALDI-TOF-MS檢測

自制純品進行MALDI-TOF-MS分析，測的峰值為[M-1]m/z 3948.1346，確定自制品的相對分子質(zhì)量為3949，與理論值3949.39一致。見圖3。

圖2　高效液相色譜對比

圖3　普蘭林肽自制品MALDI-TOF-MS檢測圖譜

2　結(jié)果與討論

本文通過合理的分析，確保最大限度降低縮合過程中空間位阻的影響，以及異構(gòu)現(xiàn)象發(fā)生的提前下，將普蘭林肽長鏈分割為7個短肽鏈，首先通過液相合成法，合成7個短肽鏈化合物，保證前期合成步驟具有較高的收率和較大的投料量。之后采用固相合成法，逐步縮合得到全保護線性普蘭林肽樹脂。用碘作為氧化劑，以TFA的混合溶劑做為裂解劑，通過反相制備液相純化得到98%以上（98.1%）的普蘭林肽產(chǎn)品。總收率為37%，具備操作簡單，效率高，成本低，收率高，產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]G ina J.Ryan,PharmaD,BCPS,CD E;Lynetta J.Jobe,D V M,PhD,etal.Pramlintide in the Treatment of Type 1 and Type 2 D iabetes M ellitus.ClinicalTherapeutics,V olume27, N umber 10,2005.

[2]H ekman CM,D emond W S,K ellley PJ,et al.Isolation and identification of cycle imide and deamidation productsinheatstressedpramlintideinjectiondrug product[J],J Pharm Biomed A nal,1999,20(5)：763-772.

[3]東圓珍，曹楠，朱裕輝，等.Fmoc法固相合成普蘭林肽［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41，(12)：901－903．

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[5]Shou X in Liu.N-M ethyl Sansalvamide A peptide analogues.potentnew antitumor agents[J].Journal of M edicinal Chemistry 2005,10(48)：3630-3638.

[6]王德心.固相有機合成原理及應(yīng)用指南[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

A New Method for the Synthesis of Pramlintide

YANG Xiao-jing1,ZHAO Hong-ling1,YIN Zhi-feng1,WANG Liang-you1,ZHANG Sen2,KOU Cheng3*
(1.Chengde Medical University；2.Hebei Veyang Animal Pharmaceutical CO.,LTD；3.Hebei Normal University for Nationalities,Chengde,Hebei 067000,China)

First of all,the long chain of pramlintide is divided into seven short peptide chains based on reasonable analysis.Taking amino acids protected by Fmoc-as original material,the seven short peptide chains are obtained with the Liquid-Phase Synthesis Method.Then fully protected linear pramlintide-resins is completed step by step by using Fmoc-Solid-Phase Synthesis Method which is carried by Amide Rink MBHA resin,with HBTU/HOBt/DIEA as condensing reagent.A disulfide bond is formed between thiols of two cysteines by oxidation of iodine.A crude product is obtained after removing the protecting group in a mixed solvent including TFA.At last the pramlintid which has more than 98%purity is obtained by purification with Reversed Phase Preparative Liquid Chromatography.The total yield of this technology is 37%.In summary,the combination method technology of liquid and solid phase synthesis is simple with high efficiency The high purity products with low cost and high yield is most suitable for industrial production.

pramlintide;Liquid-Phase Synthesis Method；Solid-Phase Synthesis Method；disulfide bond

O6

A

2095-3763（2015）02-0060-05

2014-11-18

楊曉婧（1985-），女，河北衡水人，承德醫(yī)學(xué)院講師，碩士研究生，主要從事藥物中間體合成的研究。

寇成，河北民族師范學(xué)院講師。