右美托咪定誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響

李建立，劉玉茹，張煜東，吳紅海，侯艷寧

0 引 言

氯胺酮作為一種N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)拮抗劑被廣泛用于小兒麻醉，本研究前期發(fā)現(xiàn)氯胺酮可對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元產(chǎn)生劑量依賴(lài)性損傷［1-2］，另外氯胺酮可對(duì)發(fā)育期大鼠大腦皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡樣損傷，并引起大鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能障礙［2-4］。因此尋找安全有效的措施防治氯胺酮對(duì)發(fā)育期大腦產(chǎn)生的神經(jīng)損傷是嬰幼兒麻醉時(shí)腦保護(hù)的重要研究課題。右美托咪定是高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和拮抗交感神經(jīng)活性的作用［5］，近年來(lái)研究表明右美托咪定具有神經(jīng)保護(hù)作用，并適用于嬰幼兒麻醉［6］。最近有研究表明右美托咪定不會(huì)對(duì)發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞和遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生損傷，但可對(duì)抗氯胺酮引起的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，并改善幼鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，而具體機(jī)制還不清楚［7］。因此本研究利用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元研究右美托咪定對(duì)氯胺酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào)H35020148)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)14102132)，DMEM培養(yǎng)液、Neurobasal培養(yǎng)液、B27促生長(zhǎng)劑購(gòu)自美國(guó)GIBcO公司，MTT購(gòu)自美國(guó)sigma公司。Hoechst33258與胰蛋白酶購(gòu)自北京索來(lái)寶公司。Akt、pAkt以及cleavedcaspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signal Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)的SD幼鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量5～6 g，雌雄不限，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):1306346，飼養(yǎng)溫度20～24℃，濕度50%。取其大腦額葉皮質(zhì)，在4℃的PBS液中剪碎，在37℃水浴鍋內(nèi)用0.125% 胰蛋白酶消化15 min，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化，去上清，將呈白色絮狀物的細(xì)胞加到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，制成細(xì)胞懸液。100目鋼絲篩過(guò)濾，計(jì)數(shù)按1×109/L的密度接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)板中，在5%CO2培養(yǎng)箱37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，Neurobasal+B27培養(yǎng)基全量置換原培養(yǎng)液，以后每隔2天半量換液1次。培養(yǎng)7d的神經(jīng)元細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 觀(guān)察右美托咪定對(duì)氯胺酮引起神經(jīng)元損傷的影響時(shí)，分為溶劑對(duì)照a組(等體積等滲鹽水)、氯胺酮a組(氯胺酮終濃度為100 μmol/L)、氯胺酮+右美托咪定組(100 μmol/L氯胺酮+終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1 μmol/L 的右美托咪定，并分為0.001μmol/L 亞組、0.01 μmol/L 亞組、0.1 μmol/L 亞組、1 μmol/L亞組)。檢測(cè)不同處理對(duì)神經(jīng)元凋亡、pAkt和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響，再次將神經(jīng)元細(xì)胞分為溶劑對(duì)照b組(等體積等滲鹽水)、氯胺酮b組(100 μmol/L氯胺酮)、右美托咪定+氯胺酮組(0.1 μmol/L 右 美 托 咪定 +100 μmol/L 氯胺 酮)、LY294002 預(yù)處理組(100 μmol/L 氯胺酮 +0.1 μmol/L右美托咪定+10μmol/L LY294002)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率 體外培養(yǎng)至第7天的神經(jīng)元細(xì)胞，藥物處理12 h后，去除培養(yǎng)液，加入 10 μL MTT 液，37 ℃ 孵育 4 h，加入 200 μL DMSO溶解甲臜結(jié)晶，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度值。以溶劑對(duì)照a組神經(jīng)元存活率為100%，以各處理組吸收值與溶劑對(duì)照a組的比值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 Hoechst33258核染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 給予不同藥物處理神經(jīng)元12 h后，移去培養(yǎng)液，用冷PBS洗劑3遍，然后4%多聚甲醛固定神經(jīng)元30 min，冷PBS液沖洗3遍，加入Hoechst33258染液處理神經(jīng)元8 min后，PBS漂洗3遍，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算神經(jīng)元的凋亡率。

1.2.5 Western blot法測(cè)定 pAkt和 cleaved-caspase-3蛋白水平 細(xì)胞經(jīng)各種處理后，收集細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)樣品蛋白含量。取待測(cè)蛋白質(zhì)50μg加上樣緩沖液煮沸變性，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中100V電泳1.5h，轉(zhuǎn)膜1 h，加入pAkt和 cleaved-Caspase-3 抗體(1∶2000)，4℃過(guò)夜，常規(guī)洗滌，加羊抗鼠二抗(1∶5000)37℃孵育60min，洗滌，電化學(xué)法發(fā)光、顯影、掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)β-actin蛋白為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 右美托咪定對(duì)氯胺酮誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷的影響 0.001μmol/L 亞組、0.01 μmol/L 亞組、0.1μmol/L亞組、1μmol/L亞組的神經(jīng)元存活率分別為(56.4 ±7.21)%、(60.5 ±4.2)%、(69.6 ±6.1)%、(84.5 ±7.3)%、(81.5 ±6.2)%，其中0.1μmol/L 亞組右美托咪定產(chǎn)生的保護(hù)作用最好(P＜0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用右美托咪定濃度0.1μmol/L。

2.2 右美托咪定對(duì)氯胺酮誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響 LY294002預(yù)處理組、氯胺酮b組皮層神經(jīng)元凋亡率［(36.8 ±4.4)%、(43.4±4.5)%］較溶劑對(duì)照b組［(7.5±1.1)%］、右美托咪定+氯胺酮組［(16.4 ±3.6)%］顯著增加(P ＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 右美托咪定對(duì)氯胺酮誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響Figure 1 Effect of dexmedetomidine treatment on neuron apoptosis induced by ketamine

2.3 各種處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元pAkt蛋白水平的影響 LY294002預(yù)處理組、氯胺酮b組pAkt蛋白水平(0.26 ±0.02、0.15 ±0.01)較溶劑對(duì)照 b 組(0.61 ±0.05)、右美托咪定 +氯胺酮組(0.50 ±0.04)顯著降低(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元pAkt蛋白水平的影響Figure 2 Effect of dexmedetomidine treatment on the pAkt level

2.4 各種處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元 cleavedcaspase-3蛋白水平的影響 LY294002預(yù)處理、氯胺酮 b組 cleaved-caspase-3蛋白水平(0.40±0.02、0.65 ±0.03)較溶劑對(duì)照 b 組(0.10 ±0.02)、右美托咪定+氯胺酮組(0.12±0.01)顯著增加(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot測(cè)定的不同處理對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元cleaved-caspase-3蛋白水平Figure 3 Effect of dexmedetomidine treatment on the level of cleaved-caspase-3

3 討 論

研究表明氯胺酮具有發(fā)育期神經(jīng)毒性，可對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元和發(fā)育期大鼠大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷，并引起大鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能損傷［1-2］。因此尋找安全有效的措施防治氯胺酮的發(fā)育期神經(jīng)毒性受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)α2腎上腺素受體激動(dòng)藥可樂(lè)定可對(duì)抗氯胺酮引起的發(fā)育期大腦損傷，但在嬰幼兒應(yīng)用的安全性還需進(jìn)一步探討［8］。右美托咪定是另一高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)藥，具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，作為輔助藥物廣泛應(yīng)用于臨床麻醉中。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定具有神經(jīng)保護(hù)作用，如抑制缺血再灌注損傷［9］和高氧誘導(dǎo)的發(fā)育期大腦損傷［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可抑制麻醉藥氯胺酮，異氟醚以及丙泊酚引起的發(fā)育期大鼠大腦凋亡樣損傷［7，11-12］，其機(jī)制目前還不清楚。有研究表明右美托咪定本身對(duì)發(fā)育期大腦不產(chǎn)生神經(jīng)損傷作用［13］。針對(duì)右美托咪定是否對(duì)抗氯胺酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡以及機(jī)制，本研究結(jié)果表明右美托咪定可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)抗氯胺酮誘導(dǎo)的的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡。

PI3K-Akt信號(hào)通路參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，促進(jìn)神經(jīng)元突觸的形成［14］。NMDA受體通過(guò)激活PI3KAkt信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸形成等方面發(fā)揮重要的作用，具有促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用［15］。研究表明抑制神經(jīng)元pAkt蛋白表達(dá)水平可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，而提高神經(jīng)元pAkt蛋白表達(dá)水平可抑制神經(jīng)元凋亡［16］。本研究前期研究結(jié)果表明氯胺酮通過(guò)拮抗NMDA受體，抑制神經(jīng)元pAkt蛋白水平，誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡［17］。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)抗麻醉藥異氟醚引起的發(fā)育期動(dòng)物大腦凋亡樣損傷［11］。因此推測(cè)右美托咪定可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)抗氯胺酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡，本研究結(jié)果表明右美托咪定抑制了氯胺酮引起的神經(jīng)元pAkt蛋白水平的下降，抑制氯胺酮誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡。為進(jìn)一步證實(shí)PI3K-Akt信號(hào)通路在右美托咪定保護(hù)皮層神經(jīng)元免受氯胺酮神經(jīng)損傷中的作用，本研究應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002，觀(guān)察其對(duì)神經(jīng)元pAkt蛋白水平以及神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果表明LY294002抑制了右美托咪定誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元pAkt水平的上調(diào)作用，同時(shí)也抑制了右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡和 cleavedcaspase-3蛋白水平的顯著性增加，提示右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用與PI3K-Akt信號(hào)通路有關(guān)。

總之，右美托咪定可通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)抗氯胺酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，因此使用右美托咪定和氯胺酮聯(lián)合進(jìn)行嬰幼兒麻醉的誘導(dǎo)和維持可能是有利于嬰幼兒的麻醉方法。同時(shí)本研究為圍術(shù)期應(yīng)用右美托咪定預(yù)防氯胺酮引起的發(fā)育期大腦損傷提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。

［1］ 李建立，高冬艷，杜彥茹，等.17β雌二醇對(duì)氯胺酮誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30(6):816-820.

［2］ Li J，Wang B，Wu H，et al.17beta-estradiol attenuates ketamine-induced neuroapoptosis and persistent cognitive deficits in the developing brain［J］.Brain Res，2014，1593:30-39.

［3］ 張 銀，高 瑩，黃 錦，等.氯胺酮分別聯(lián)合異丙嗪、戊巴比妥鈉和水合氯醛藥物用于兔麻醉效果的比較與評(píng)價(jià)［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(12):1241-1243.

［4］ 余志陽(yáng)，吳智方，徐苗苗，等.二異丙酚復(fù)合氯胺酮在經(jīng)皮內(nèi)鏡下胃造口空腸置管術(shù)的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(7):775-776.

［5］ 李新靈，雷 鐘，杜 靖，等.不同劑量右美托咪定對(duì)大鼠腎缺血再灌注后心肌組織損傷的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2015，28(8):809-814.

［6］ Strom S.Preoperative evaluation，premedication，and induction of anesthesia in infants and children［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2012，25(3):321-325.

［7］ Duan X，Li Y，Zhou C，et al.Dexmedetomidine provides neuroprotection:impact on ketamine-induced neuroapoptosis in the developing rat brain［J］.Acta Anaesthesiol Scand，2014，58(9):1121-1126.

［8］ Ponten E，Viberg H，Gordh T，et al.Clonidine abolishes the adverse effects on apoptosis and behaviour afte neonatal ketamine exposure in mice［J］.Acta Anaesthesiol Scand，2012，56(8):1058-1065.

［9］ 張曉青，賈建麗，馮明靜，等.右美托咪定減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33(1):117-118.

［10］ Sifringer M，von Haefen C，Krain M，et al.Neuroprotective effect of dexmedetomidine on hyperoxia-induced toxicity in the neonatal ratbrain ［J］. Oxid Med CellLongev， 2015，PMID530371.

［11］ Li Y，Zeng M，Chen W，et al.Dexmedetomidine reduces isoflurane-induced neuroapoptosis partly by preserving PI3K/Akt pathway in the hippocampus of neonatal rats［J］.PLoS One，2014，9(4):e93639.

［12］ Li J，Xiong M，Nadavaluru PR，et al.Dexmedetomidine attenuates neurotoxicity induced by prenatal propofol exposure［J］.J Neurosurg Anesthesiol，2015，PMID:25844953.

［13］ Koo E，Oshodi T，Meschter C，et al.Neurotoxic effects of dexmedetomidine in fetal cynomolgus monkey brain［J］.J Toxicol Sci，2014，39(2):251-262.

［14］ Luikart BW，Zhang W，Wayman GA，et al.Neurotrophin-dependent dendritic filopodial motility:a convergence on PI3K signalling［J］.J Neurosci，2008，28(27):7006-7012.

［15］ Sutton G，Chandler LJ.Activity-dependent NMDA receptor-mediated activation of protein kinase B/Akt in cortical neuronal cultures［J］.Neurochem，2002，82(5):1097-1105.

［16］ Shang Y，Wu Y，Yao S，et al.Protective effect of erythropoietin against ketamine-induced apoptosis in cultured rat cortical neurons:involvement of pi3k/akt and gsk-3 beta pathway［J］.Apoptosis，2007，12(12):2187-2195.

［17］ Li J，Wu H，Xue G，et al.17b-oestradiol protects primary-cultured rat cortical neurons from ketamine-induced apoptosis by activating PI3K/Akt/Bcl-2 signalling［J］.Basic Clinical Pharmacology Toxicology，2013，113(6)，411-418.