應(yīng)用熒光RT-PCR方法檢測H7N9亞型禽流感病毒

葉惠儀，丁妙霞，黃江志，黃炳熾，黃育浩，張險朋

（1.廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2東莞市動物疫病預防控制中心，廣東 東莞 523086）

應(yīng)用熒光RT-PCR方法檢測H7N9亞型禽流感病毒

葉惠儀1，丁妙霞1，黃江志1，黃炳熾2，黃育浩2，張險朋2

（1.廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2東莞市動物疫病預防控制中心，廣東 東莞 523086）

為了驗證熒光RT-PCR方法檢測H7N9亞型禽流感病毒的可行性，應(yīng)用建立的熒光RT-PCR方法檢測H7N9亞型禽流感抗原、H9亞型禽流感抗原、H5亞型禽流感抗原、新城疫抗原評估檢測方法的特異性，檢測不同稀釋度的H7N9亞型禽流感抗原，并用建立的方法檢測采自三鳥批發(fā)市場100份泄殖腔、喉拭子。結(jié)果是建立的熒光RT-PCR方法，H7體系能檢測出1：10-10抗原稀釋度，N9體系能檢測1：10-9抗原稀釋度，對H9亞型禽流感抗原、H5亞型禽流感抗原、新城疫抗原無交叉反應(yīng)；檢出100份泄殖腔、喉拭子結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，熒光RT-PCR方法H7N9亞型禽流感病毒具有快速、靈敏、特異的特點，適合對禽類的大規(guī)模監(jiān)測。

H7N9亞型禽流感；熒光RT-PCR；禽類；檢測

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，病毒基因組由8個單股負鏈RNA組成，編碼10種蛋白，根據(jù)糖蛋白HA和NA的血清學反應(yīng)情況進一步分為若干亞型。目前，已從水禽中分離到了16種HA與9種NA亞型的A型流感病毒。家禽感染AIV后，表現(xiàn)為高致病力，中度致病力，低致病力和無致病力。禽流感病毒H5N1、H5N2、H9N2、H7N7、H10N7以及H10N8等均有感染人的報道。2013年3年31日首先在中國上海和安徽發(fā)現(xiàn)了3例人感染H7N9禽流感病例，根據(jù)全國法定傳染病疫情報告，截至2015年6月30日，全國累計人感染H7N9禽流感病例達到537例，死亡227例。H7N9亞型禽流感雖然在家禽中表現(xiàn)為低致病性，但是嚴重威脅到公共衛(wèi)生的安全，對于防控該病，實施監(jiān)測和早期的診斷顯得尤為重要。近幾年來，熒光PCR技術(shù)得到了很大的發(fā)展,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物疫病監(jiān)測和診斷，為了驗證應(yīng)用熒光RT-PCR方法檢測H7N9亞型禽流感病毒可行，對該方法的特異性、敏感性、重復性并采取了臨床樣品進行了試驗，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器H7N9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司，批號為：2015002；H5亞型禽流感抗原（Re-6株）、H9亞型禽流感抗原：購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，批號分別為：2013004，2013002；新城疫抗原購自哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司，批號：20150116；病毒RNA提取試劑盒（離心柱法）購自中山大學達安基因股份有限公司，批號：20140724。

1.1.2 儀器與設(shè)備ABI 7500熒光PCR儀，購自美國ABI公司。

1.1.3 樣品來源雞泄殖腔、后拭子共100只采自東莞市常平鎮(zhèn)三鳥批發(fā)市場。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取方法在1.5mL的無菌離心管內(nèi)加入50μL蛋白酶K；取200μL樣品加入離心管中；加入200μL已含Carrier RNA的裂解液，漩渦振蕩15s充分混勻，瞬時離心，72℃，10min；加入250μL乙醇，漩渦振蕩15s；將混合液全部吸至離心柱，室溫下12000g離心1min，將離心柱裝至新的收集管；將500μL的抑制物去除液加入離心柱，室溫下12000g離心1min，將離心柱裝至新的收集管；將500μL的去離子液加入離心柱，室溫下12000g離心1min，將離心柱裝至新的收集管；將離心柱收集管室溫下14000g離心3min除去參與乙醇；將離心柱取出，放置于新的1.5mL，打開離心柱蓋子，72℃放置2min；在離心柱膜的正上方加入72℃預熱的洗脫液50μL，靜止1min，14000g離心1min，核酸-20℃保存。

1.2.2 熒光RT-PCR方法分別配置H7和N9反應(yīng)體系，每管加入反應(yīng)液A 17μL，反應(yīng)液B 3μL。探針檢測模式設(shè)置為：ReporterDye1：FAM，QuencherDye：NONE，Passive Reference：NONE。反應(yīng)條件設(shè)置為：50℃15min，1個循環(huán)；95℃15min，1個循環(huán)；94℃15s，58℃45s（收集熒光），45個循環(huán)。陰性質(zhì)控無擴增曲線Undet，陽性質(zhì)控有擴增曲線，Ct值小于等于32結(jié)果成立。結(jié)果判定：如果H7及N9反應(yīng)體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值大于42判為H7N9亞型禽流感病毒陰性；如果H7及N9反應(yīng)體系FAM檢測通道均有擴增曲線，且Ct值小于等于42判為H7N9亞型禽流感病毒陽性；如果僅H7或N9反應(yīng)體系僅其中的擴增曲線滿足判為陽性，則只能判定H7亞型或N9亞型禽流感病毒陽性。

2 結(jié)果

2.1 H7 N9 亞型禽流感抗原檢測結(jié)果以10-2～10-11各稀釋度H7N9禽流感抗原為模板，用離心柱法提取方法提取核酸，然后用同一試劑盒方法同時上機檢測，檢測結(jié)果為H7能檢測出1：10-10抗原稀釋度，N9能檢測1：10-9抗原稀釋度，詳細結(jié)果見表1。

表1 不同稀釋度H7N9亞型禽流感熒光RT-PCR檢測結(jié)果

2.2 特異性試驗檢測結(jié)果分別用H7N9亞型禽流感抗原、H9亞型禽流感抗原、H5亞型禽流感抗原、新城疫抗原強1：1000稀釋，用離心柱法提取方法提取核酸，用同一試劑盒方法同時上機檢測，結(jié)果為陽性質(zhì)控、臨界陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控成立，H7N9亞型禽流感抗原H7反應(yīng)體系CT值為19.01，N9反應(yīng)體系CT值為20.22，H9亞型禽流感抗原、H5亞型禽流感抗原、新城疫抗原的H7和N9體系檢測結(jié)果均為陰性。

2.3 重復性試驗用離心柱法3次平行提取病毒RNA為模板，同時用同種試劑進行檢測,對其重復性進行分析，變異系數(shù)（CV）為1.13%,重復性良好。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果檢測100份雞泄殖腔、喉拭子結(jié)果均為陰性。

3 討論

H7N9亞型禽流感病毒是一種新型重組的A型流感病毒，2013年2月在中國華東地區(qū)首發(fā)并呈高度散發(fā)狀態(tài),雖然對家禽無癥狀或低致病性，但對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴重的威脅。由于此病對家禽無癥狀或低致病性，所以應(yīng)用快速的實驗室檢測方法，對該病進行監(jiān)測顯得尤為重要。熒光PCR技術(shù)作為一種快速、準確、特異方法已廣泛用于動物疫病監(jiān)測和發(fā)生動物疫情時的早期診斷該方法操作簡便，從核酸提取到出結(jié)果僅需3h，熒光PCR不僅實現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，熒光PCR技術(shù)由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性,又可進一步提高靈敏度；熒光PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理,避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復性。根據(jù)試驗結(jié)果，應(yīng)用建立的熒光RT-PCR方法檢測H7N9亞型禽流感抗原，H7體系可以檢測到1：10-10抗原稀釋度，N9體系能檢測到1：10-9抗原稀釋度，且對H9亞型禽流感抗原、H5亞型禽流感抗原、新城疫抗原無交叉反應(yīng)，重復性試驗變異系數(shù)為1.13%，證明該方法敏感度比較高，特異性好，重復性好，適合大規(guī)模的動物疫病監(jiān)測。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.027