實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同泌乳時(shí)期奶牛乳腺中肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)

遲超，劉芳萍，孔慶賀

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，哈爾濱 150069）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同泌乳時(shí)期奶牛乳腺中肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)

遲超1，2，劉芳萍1，孔慶賀2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，哈爾濱 150069）

肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體（POT）家族成員之一，它以H+梯度為動(dòng)力，將絕大多數(shù)二肽和三肽等小肽從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分I型（Pept1）和II型（Pept2）兩種。過去對(duì)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究主要集中于在消化道中，不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分布及其對(duì)小肽等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)上。但，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，不同種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同組織中有不同的分布于功能，如Pept1乳腺組織中乳蛋白的合成可能有一定作用；Pept2在腎臟中對(duì)腎臟的重吸收功能，在肺中對(duì)肺部的免疫保護(hù)等均起重要作用。

本試驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)青春期、妊娠期、泌乳期（高品質(zhì)乳與低品質(zhì)乳）和退化期等時(shí)期那牛乳腺組織中兩種肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)變化。試驗(yàn)既為Pept1在乳腺中的功能研究提供了思路，又為奶牛乳腺響應(yīng)小肽等營養(yǎng)素調(diào)節(jié)泌乳信號(hào)通路的完善提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

健康的青春期、妊娠期、泌乳期（分產(chǎn)高品質(zhì)奶組織樣與產(chǎn)低品質(zhì)奶組織樣）與退化期中國荷斯坦奶牛組織各5份，共25份，取自黑龍江某奶牛場(chǎng)；實(shí)時(shí)熒光定量相關(guān)試劑購于寶生物公司；7300Real-Time PCR儀購于美國Applied Biosystems公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織RNA的提取本試驗(yàn)用Trizol法進(jìn)行組織中總RNA的提取。其具體過程參見文獻(xiàn)。提取的RNA用1%的凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，且用無RNA酶的ddH20稀釋至各組樣品中RNA濃度一致。稀釋好的RNA立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 qRT-PCR特異性引物設(shè)計(jì)以NCBI GeneBank中公布的牛的Pept1、Pept2和β-actin序列，用Primer Premier V5.0軟件進(jìn)行qRT-PCR特異性引物設(shè)計(jì)。引物由Invitrogen公司合成。引物序列如表1。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)各時(shí)期組樣品中Pept mRNA的表達(dá)組樣品中Pept mRNA的qRT-PCR檢測(cè)方法主要參見文獻(xiàn)。其過程簡(jiǎn)略如下：將上一步試驗(yàn)提取的RNA用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以此cDNA為模板，用Pept1、Pept2、β-actin的特異性qRT-PCR引物進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR的體系及條件參見qRT-PCR試劑盒說明書。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)泌乳期高品質(zhì)乳與低品質(zhì)乳組織中Pept mRNA的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)的操作過程同前文所述。

試驗(yàn)選取青春期、妊娠期、泌乳期（分產(chǎn)高品質(zhì)奶與產(chǎn)低品質(zhì)奶）與退化期等幾個(gè)時(shí)期的奶牛乳腺組織，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組織中I型和II型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，I型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)在青春期較低，在妊娠期與泌乳期顯著上升，至泌乳期達(dá)到頂峰，在退化期下降至青春期水平；II型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各個(gè)時(shí)期表達(dá)無明顯變化；在泌乳期高品質(zhì)乳組織中，I型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)顯著高于低品質(zhì)乳組織，且在這兩組樣品中，I型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)均顯著高于II型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示，在奶牛泌乳過程中，I型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與泌乳的調(diào)節(jié)有顯著的正相關(guān)性，而II型肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與泌乳的調(diào)節(jié)無明顯關(guān)系。

二肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；奶牛；乳腺

表1 qRT-PCR特異性引物

2 結(jié)果

2.1 組織RNA的提取

用Trizol提取各時(shí)期奶牛乳腺組織中總RNA，凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。結(jié)果如圖1，各個(gè)樣品的RNA均28S、18S和5S三條帶，且由28S到5S條帶亮度呈遞減的趨勢(shì)，這說明本試驗(yàn)中提取的組織RNA質(zhì)量合格，沒有降解現(xiàn)象且無DNA或蛋白質(zhì)污染，用無RNA酶的ddH20調(diào)節(jié)各組RNA濃度達(dá)到一致后就能用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 組織RNA提取的凝膠電泳結(jié)果圖

M:Marker DL2000；1-5：分別為青春期、妊娠期、泌乳期（高品質(zhì)乳）、泌乳期（低品質(zhì)乳）、退化期組織樣的RNA。各時(shí)期均選一個(gè)樣品為代表。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)各時(shí)期組織樣品中Pept mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)各時(shí)期組織中Pept mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2所示，對(duì)Pept1來說，青春期表達(dá)量較低；妊娠期表達(dá)量上升，且較青春期顯著升高；泌乳期表達(dá)量大幅度上升，且較青春期和妊娠期均顯著升高，表達(dá)量達(dá)到頂峰；退化期表達(dá)量顯著下降，較妊娠期和泌乳期均顯著降低，且比青春期略低，表達(dá)量下降至最低水平，從整個(gè)過程來看，Pept1在妊娠期表達(dá)開始上升，且上升趨勢(shì)一直維持到泌乳期達(dá)到頂峰，然后在退化期下降至略低于青春期水平。對(duì)Pept2來說，雖然在泌乳期表達(dá)量稍有上升，上升量不顯著，從整個(gè)過程來看，Pept2在青春期、妊娠期、泌乳期與退化期的表達(dá)無顯著變化。結(jié)果說明，在奶牛泌乳過程中，Pept1與泌乳的調(diào)節(jié)有明顯的正相關(guān)性，而Pept2與泌乳的調(diào)節(jié)無明顯關(guān)系。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)各時(shí)期組織中Pept1和Pept2 mRNA的表達(dá)

2.3 qRT-PCR檢測(cè)泌乳期高品質(zhì)乳與低品質(zhì)乳組織中Pept mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)泌乳期高品質(zhì)乳與低品質(zhì)乳組織中Pept mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，在高品質(zhì)乳組織中，Pept1的表達(dá)量顯著高于低品質(zhì)乳組織，并且在同一組織中，不管是高品質(zhì)乳組織還是低品質(zhì)乳組織，Pept1的表達(dá)均顯著高于Pept2。結(jié)果說明在奶牛泌乳過程中，Pept1與泌乳的調(diào)節(jié)有明顯的正相關(guān)性，而Pept2與泌乳的調(diào)節(jié)無明顯關(guān)系。此結(jié)果與前面結(jié)果一致。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)泌乳期高乳品質(zhì)組織樣與低乳品質(zhì)組織樣中Pept1和Pept2 mRNA的表達(dá)。H：高乳品質(zhì)組織樣；L：低乳品質(zhì)組織樣。

3 討論

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體是具有多個(gè)中心的跨膜蛋白，它在細(xì)胞外側(cè)有一個(gè)大的親水外環(huán)，在細(xì)胞內(nèi)側(cè)有一個(gè)較小的內(nèi)環(huán)，在它的外環(huán)上有數(shù)個(gè)糖基化位點(diǎn)，內(nèi)環(huán)上有蛋白激酶C和蛋白激酶A的磷酸化作用位點(diǎn)。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的這些作用位點(diǎn)是它發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。過去的研究認(rèn)為小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要分布在機(jī)體的消化道中，主要參與腸道內(nèi)的二肽和三肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在不同組織中有不同程度的表達(dá)，如Pept1在腎小管上皮細(xì)胞中、乳腺組織中高表達(dá)；Pept2在腎臟、大腦、肺及胰腺中高表達(dá)。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的這些分布與表達(dá)的變化提示我們，除了傳統(tǒng)的參與腸道內(nèi)的二肽和三肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能外，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體可能還存在別的多種未知的功能，并且這些功能可能具有組織特異性。

本試驗(yàn)檢測(cè)了青春期、妊娠期、泌乳期與退化期等幾個(gè)時(shí)期奶牛乳腺組織中，Pept1和Pept2的表達(dá)情況，結(jié)果表明，Pept1的表達(dá)在泌乳過程中的不同時(shí)期有很大的變化，且變化趨勢(shì)跟泌乳一致，而Pept2的表達(dá)在泌乳過程中的不同時(shí)期變化不明顯。此外，本試驗(yàn)還檢測(cè)了泌乳期高乳品質(zhì)組織樣和低乳品質(zhì)組織樣中Pept1和Pept2的表達(dá)，結(jié)果表明，在泌乳期高品質(zhì)乳組織中，Pept1的表達(dá)顯著高于低品質(zhì)乳組織，且在這兩組樣品中，Pept1的表達(dá)均顯著高于Pept2的表達(dá)。這些結(jié)果提示，在奶牛乳腺組織中，Pept1可能是一個(gè)重要的泌乳調(diào)節(jié)因子，對(duì)乳腺組織的泌乳具有重要的正向調(diào)節(jié)作用，而Pept2可能跟乳腺組織的泌乳無直接關(guān)系。

[1]Doring F，et al.Functional analysis of a chimeric mammalian peptide transporter derived from the intestinal and renal isoforms [J].Journal of Physiology,1996,497:773-779.

[2]Daniel H，et al.From bacteria to man:archaic proton-dependent peptide transporters at work[J].Physiology,2006,21:93-102.

[3]Rubio-Aliaga I，et al.Peptide transporters and their roles in physiological processes and drug disposition[J].Xenobiotica，2008，38（7/8）:1022-1042.

[4]Xiang J M，et al.Kyotorphin transport and metabolism in rat and mouse neonatal astrocytes[J].Brain Research,2010,1347:11-18.

[5]Biegel A，et al.Structural requirements for the substrates of the H+/peptide cotransporter PEPT2 determined by three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis[J].Journal of Medicine Chemistry，2006，49:4286-4296.

[6]Shen H，et al.Immunolocalization of the proton-coupled oligopeptide transporter PEPT2 in developing rat brain[J].Molecular Pharmaceutics，2004，1:248-256.

[7]朱宇旌，等.小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1的生物學(xué)特性及其功能[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（10）:1847-1853.

[8]楊建香，等.小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及功能研究[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25（6）:1174-1179.

[9]趙東欣.寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PepT2及其藥物轉(zhuǎn)運(yùn)[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26（1）:1-8.

[10]Groneberg D A，et al.Peptide transport in the mammary gland: expression and distribution of PEPT2 mRNA and protein[J].The American Journal of Physiological:Endocrinol and Metabolism，2002，282（5）:1172-1179.

[11]Wenzel U，et al.Regulation of the high-affinity H+/peptide cotransporter in renal LLC-PK1 cells[J].Journal of Cell Physiology，1999，178（3）:341-348.

[12]Doring F，et al.Hypothyroidism induces expression of the peptide transporter PEPT2[J].Biochemistry，2005，386（8）:785-790.

[13]周苗苗,等.泌乳反芻動(dòng)物乳腺中小肽的攝取、利用及影響因素[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23（3）:378-380.

[14]Brandsch M，et al.Influence of proton and essential histidyl residues on the transport kinetics of the H+/peptide cotransport systems in intestine（PEPT1）and kidney（PEPT2）[J].Biochimica Biophysica Acta，1997，1324（2）:251-262.

[15]Smith DE，et al.Distribution ofglycylsarcosine and cefadroxilamong cerebrospinal fluid，choroid plexus，and brain parenchyma after intracerebroventricular injection is markedly different between wild-type and Pept2 null mice[J].Journal of Cerebral Blood Flow &Metabolism，2011，31:250-261.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.024