固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血液中海洛因及其代謝產(chǎn)物

張 松，曹峻華，劉文文（.重慶市公安局交通管理局，重慶 400054；.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 4000）

固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血液中海洛因及其代謝產(chǎn)物

張 松1，曹峻華1，劉文文2
（1.重慶市公安局交通管理局，重慶 400054；2.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021）

建立了固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-LC-MS／MS）法分析吸毒者血樣中的O6-單乙酰嗎啡、嗎啡、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡。以3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡-d3為內(nèi)標(biāo)，選取Oasis HLB為固相萃取柱，AtlantisTMdC18（150mm×3.9mm×5μm）色譜柱為分析柱，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；采用電噴霧正離子電離源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式，通過兩對(duì)母離子／子離子和保留時(shí)間定性定量檢測(cè)目標(biāo)化合物。結(jié)果表明：血樣中O6-單乙酰嗎啡、嗎啡、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡的檢測(cè)限為3～5μg／L，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.997 5以上；添加50、500、1 000μg／L加標(biāo)水平后，O6-單乙酰嗎啡、嗎啡、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡的平均回收率為80.6%～98.9%，準(zhǔn)確度為-7.3%～9.1%。該方法具有較高的靈敏度和選擇性，可用于實(shí)際案件中海洛因及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）；固相萃?。⊿PE）；O6-單乙酰嗎啡；嗎啡；3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡

海洛因又稱雙乙酰嗎啡，是目前依賴潛力最強(qiáng)的毒品，成癮者對(duì)其具有高度的心理及生理依賴性，難以戒除。因此，及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)海洛因及其代謝產(chǎn)物，對(duì)于防止毒品泛濫、禁毒及戒毒、保護(hù)人民身心健康具有重大意義。海洛因在體內(nèi)的代謝較快，經(jīng)體內(nèi)的酯酶水解成單乙酰嗎啡（主要是O6-單乙酰嗎啡），繼而代謝成嗎啡，嗎啡的3位酚羥基和6位醇羥基分別與葡萄糖醛酸結(jié)合，絕大部分生成3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡（M3G），少量轉(zhuǎn)化為6-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡（M6G）［1-2］。因此，在人體內(nèi)很難檢測(cè)到海洛因原體，O6-單乙酰嗎啡則作為特征代謝產(chǎn)物被用于判斷是否攝入海洛因的依據(jù)。

海洛因及其主要代謝產(chǎn)物的常用檢測(cè)方法有GC／MS法［3-5］、高效液相色譜法（HPLC）法［6-7］、LC／MS［8-9］法及LC-MS／MS法［10-12］等。其中，GC／MS法需要酸水解，整個(gè)過程的檢材量大、操作復(fù)雜、不易控制、無法準(zhǔn)確定量；HPLC法的檢測(cè)器靈敏度較低，在檢測(cè)藥物含量較低時(shí)會(huì)導(dǎo)致無法檢出；LC／MS法的抗干擾能力較差；而LC-MS／MS法將液相色譜的高效在線分離能力與串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性集于一體，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)的要求。

本研究擬采用固相萃取法（SPE）對(duì)檢材進(jìn)行前處理，LC-MS／MS法檢測(cè)血液中海洛因及其主要代謝產(chǎn)物（O6-單乙酰嗎啡、嗎啡、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡），旨為臨床、法醫(yī)毒物分析檢測(cè)提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

API2000LC-MS／MS聯(lián)用儀：美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；LC-20A型高效液相色譜儀，Caliper Rapid Trace固相萃取儀：日本島津公司產(chǎn)品；AE240電子天平（十萬分之一）：瑞士Mettler公司產(chǎn)品；Beckman Allegra X-22RCentrifuge型冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；Millipore Direct-Q3型純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

海洛因、嗎啡、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、O6-單乙酰嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品及3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡-d3（M3G-d3）內(nèi)標(biāo)物：均由國(guó)藥公司提供；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Analyst1.4.1分析軟件處理。

1.2 溶液的配制

分別準(zhǔn)確量取1mg O6-單乙酰嗎啡、嗎啡、M3G標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確量取0.1、0.2mL混合標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1、2mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。取0.05mL 100mg／L M3G-d3標(biāo)準(zhǔn)品于50mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100μg／L內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3 工作曲線的繪制

將100mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液分別配制成0.1、0.5、1、5、20mg／L 5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取5份0.9mL空白全血，依次加入0.1mL各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻后，用含1.5mL 100μg／L M3G-d3的水溶液稀釋，離心，經(jīng)固相萃取柱（Oasis HLB）萃取后，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，由Analyst1.4.1分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品處理方法

向1mL血液樣品中加入含1.5mL 100μg／L M3G-d3的水溶液稀釋，離心，取上清液，待過柱；取Oasis HLB固相萃取柱，依次加入1mL甲醇、1mL去離子水活化，取上清液過柱，然后用1mL去離子水清洗，2mL甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈桑?.5mL初始流動(dòng)相溶解，待檢測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：AtlantisTMdC18柱（150mm×3.9mm×5μm）；流速0.5mL／min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相：甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～3 min、 20%A～90%A，3～9min、90%A～20%A；總采樣時(shí)間12min。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式，正離子掃描，電噴霧電壓5 200V，霧化氣壓力35Pa，氣簾氣壓力20Pa，離子源溫度400℃，碰撞氣為氬氣。每個(gè)化合物設(shè)兩對(duì)母離子／子離子（3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡和內(nèi)標(biāo)只有1對(duì)母離子／子離子響應(yīng)較明顯），各MRM參數(shù)列于表1。

表1 嗎啡、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、內(nèi)標(biāo)、O6-單乙酰嗎啡、海洛因的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of morphine，M3G，M3G-d3，O6-monoacetylmorphine and heroin

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜圖

按1.5節(jié)條件測(cè)得的人空白全血色譜圖中不存在3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、海洛因等藥物的干擾，也無其他雜質(zhì)，說明本方法的特異性良好。

3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡及內(nèi)標(biāo)、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、海洛因在1.5.1節(jié)條件下的保留時(shí)間分別為4.61、5.81、7.29、8.49min，色譜行為良好，其總離子流色譜圖示于圖1。

2.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限與定量下限

取經(jīng)1.2和1.4節(jié)處理好的樣品，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）對(duì)樣品中化合物的濃度（x）作圖，各化合物的線性關(guān)系良好；當(dāng)信噪比S／N＝3時(shí)，3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡的定量下限均為10μg／L；各化合物的檢測(cè)限、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)列于表2。

2.3 回收率、精密度及準(zhǔn)確度

向空白全血中添加低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使添加標(biāo)樣的濃度分別為50、500、1 000μg／L，每個(gè)加標(biāo)水平取5個(gè)平行樣，測(cè)得各加標(biāo)水平的平均回收率，同時(shí)計(jì)算各濃度血樣測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，結(jié)果列于表3。重復(fù)測(cè)定低、中、高濃度的樣品6次，得到日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定4天，得到日間精密度，結(jié)果列于表4。

圖1 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡及內(nèi)標(biāo)（a）、嗎啡（b）、O6-單乙酰嗎啡（c）和海洛因（d）的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of M3Gand M3G-d3（a），morphine（b），O6-monoacetylmorphine（c）and heroin（d）

表2 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡和O6-單乙酰嗎啡的檢測(cè)限、定量限和線性關(guān)系Table 2 The detection limits，quantification limits，linear equations and coefficients of M3G，morphine and O6-monoacetylmorphine

表3 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡的回收率和準(zhǔn)確度Table 3 The recoveries and accuracies of M3G，morphine，O6-monoacetylmorphine

表4 3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡的日內(nèi)和日間精密度Table 4 The intra-day and inter-day precisions of M3G，morphine，O6-monoacetylmorphine

2.4 實(shí)際應(yīng)用舉例

案例1：2013年7月，李某駕駛小型轎車在重慶市某區(qū)人民法院前路段與6車發(fā)生連續(xù)相撞，造成1人重傷，7車受損的重大道路交通事故。事故發(fā)生后，民警發(fā)現(xiàn)李某有吸毒駕駛機(jī)動(dòng)車嫌疑，后在李某血液中檢出嗎啡和3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡，其含量分別為126μg／L、83μg／L。

案例2：2014年2月，在重慶市南岸區(qū)發(fā)生了一起司機(jī)劉某死于自己車內(nèi)的事件，其右手握有塑料針管，針頭部分有血跡。后在死者所持針管中檢出海洛因、單乙酰嗎啡；在劉某血液中檢出O6-單乙酰嗎啡、嗎啡和3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡，其含量分別為221μg／L、983μg／L（已達(dá)致死量）、392μg／L，其色譜圖示于圖2。

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)海洛因及其代謝產(chǎn)物的方法，可實(shí)現(xiàn)4種藥物在10min內(nèi)的快速檢測(cè)。該方法的抗干擾能力強(qiáng)、檢測(cè)速度快，具有保留時(shí)間和串聯(lián)質(zhì)譜特征離子對(duì)確證的優(yōu)點(diǎn)；且定量準(zhǔn)確、靈敏度高，能滿足同時(shí)檢測(cè)海洛因、3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡和O6-單乙酰嗎啡4種藥物的要求。

圖2 案件2的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of case two

［1］ 鐘大放.藥物代謝［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1995：8-13.

［2］ 呂海茹.尿中嗎啡常見檢測(cè)方法［J］.刑事技術(shù)，2008，（2）：29-31.

LV Hairu.Detection of morphine in urine［J］.Forensic Science and Technology，2008，（2）：29-31（in Chinese）.

［3］ 姬曉新.血中嗎啡的GC-MS檢驗(yàn)［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2004，23（9）：35-36.

JI Xiaoxin.GC-MS test morphine in blood［J］.Journal of Instrumental Analysis，2004，23（9）：35-36（in Chinese）.

［4］ 何國(guó)標(biāo)，蔣碩勤，羅正堅(jiān).嗎啡類毒品的固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（增刊）：11-12.

HE Guobiao，JIANG Shuoqin，LUO Zhengjian.Determination of morphine-type drugs in urine by SPE／GC-MS［J］.Journal of Instrumental Analysis，2008，27（Suppl）：11-12（in Chinese）.

［5］ 蔡錫蘭，吳國(guó)萍.膜提取氣相色譜／質(zhì)譜大體積進(jìn)樣檢測(cè)海洛因吸食者尿液中的代謝物［J］.分析化學(xué)，2002，30（1）：126.

CAI Xilan，WU Guoping.Determination of heroin metabolites in urine of addicts by using the solid phase membrane extractor and GC／MS largevolume injection method［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2002，30（1）：126（in Chinese）.

［6］ GHAZI-KHANSARI M，ZENDEHDEL R，PIRALIHAMEDANI M，et al.Determination of morphine in the plasma of addicts in using Zeolite Y extraction following high-performance liquid chromatography［J］.Clinica Chimica Acta，2009，364（1／2）：235-238.

［7］ 張小婷.超高效液相色譜法（UPLC）同時(shí)篩選檢測(cè)嗎啡等7種常見毒品［J］.刑事技術(shù)，2008，（6）：11-12.

ZHANG Xiaoting.The analysis of common abuse drugs by UPLC simultaneously［J］.Forensic Science and Technology，2008，（6）：11-12（in Chinese）.

［8］ TAYLOR K，ELLIOTT S.A validated hybrid quadrupole linear ion-trap LC-MS method for the analysis of morphine and morphine glucuronides applied to opiate deaths［J］.Forensic Science International，2009，187（1／2／3）：34-41.

［9］ SVENSSON J O，ANDERSSON M，GUSTAVSSON E，et al.Electrospray LC-MS method with solidphase extraction for accurate determination of morphine，codeine，and ethylmorphine-glucuronides and 6-acetylmorphine in urine［J］.Anal Toxicol，2007，31（2）：81-86.

［10］梁晨，葉海英，張玉榮，等.吸毒者尿樣中3-β-D-葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的LC-MS／MS分析［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2010，31 （2）：224-227.

LIANG Chen，YE Haiying，ZHANG Yurong，et al.Determination of morphine-3-β-D-glucuroinde，morphine，O6-monoacetylmorphine and codeine in heroin addicts’urine by LC-MS／MS［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2010，31（2）：224-227（in Chinese）.

［11］王俊偉，郭亞飛，王繪軍，等.葡萄糖醛酸嗎啡的LC-MS／MS檢驗(yàn)方法研究［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2007，26（9）：130-134.

WANG Junwei，GUO Yafei，WANG Huijun，et al.A study on the determination method of morphine glucuronide by HPLC-MS／MS［J］.Journal of Instrumental Analysis，2007，26（9）：130-134（in Chinese）.

［12］梁晨，葉海英，張玉榮，等.柱切換LC-MS／MS分析吸毒者尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱颍跩］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2011，32（3）：159-163.

LIANG Chen，YE Haiying，ZHANG Yurong，et al.Determination of morphine，O6-monoacetylmorphine，codeine and acetylcodeine in heroin addicts’urine by on-line solid-phase extraction liquid chromatography with tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2011，32（3）：159-163（in Chinese）.

Determination of Heroin and Its Metabolites in Addicts’Blood by Solid Phase Extraction and LC-MS／MS

ZHANG Song1，CAO Jun-hua1，LIU Wen-wen2
（1.Chongqing Traffic Management Bureau，Chongqing400054，China；
2.Chongqing Institute of Forensic Science，Chongqing400021，China）

O6-Monoacetylmorphine，morphine，morphine-3-β-D-glucuronide in addicts’blood samples were analyzed by solid phase extraction（SPE）and liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS／MS）.The samples were extracted by extraction column（Oasis HLB），and then were flushed into the analytical column（AtlantisTMdC18（150mm×3.9mm×5μm））with methanol and water containing formic acid as mobile phase and morphine-3-β-D-glucuronide-d3as internal standard.The positive electric spray ionization，multiple reaction monitoring（MRM）mode were applied to analyze target compounds.Identification was based on the compound’s retention time and two pairs of precursor-to-product ion transitions.The results show that the limit of detections are 3-5μg／L for morphine，O6-monoacetylmorphine and morphine-3-β-D-glucuronide.The linear relationship is well，and the linear correlation coefficient is greater than 0.997 5.The average recoveries are 80.6%-98.9%with the spiked levels of 50，500，1 000μg／L，and the accuracies are-7.3%-9.1%.The method has high sensitivity and selectivity，which is suitable for analyzing the heroin and its metabolites in addicts’blood samples.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS／MS）；solid phase extraction（SPE）；O6-monoacetylmorphine；morphine；morphine-3-β-D-glucuronide

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0367-05

10.7538／zpxb.youxian.2015.0020

2014-08-22；

修回日期：2014-12-01

張 松（1978—），男（漢族），山東濟(jì)寧人，工程師，從事理化檢驗(yàn)工作。E-mail：zhangsong＿2008＠163.com

時(shí)間：2015-05-26；

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0915.006.html