氧電極法測(cè)定發(fā)芽苦蕎中過氧化氫酶活性的研究

陳曉嫚，余倩虹，郭元新

(安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100）

苦蕎(Fagopyrum Tataricum)是中國(guó)傳統(tǒng)的雜糧作物，富含其它糧食作物中幾乎沒有的蘆丁及硒元素，是一種糧藥兼用的蓼科蕎麥屬雙子葉作物。研究表明，苦蕎發(fā)芽后蛋白酶抑制劑含量及植酸含量降低，營(yíng)養(yǎng)成分更加合理?？刂瓢l(fā)芽條件，還能富集γ－氨基丁酸(γ－amino butyric acid，GABA)等功能性成分[1]。

在低氧、鹽脅迫、冷激等逆境條件下植物中GABA含量急劇升高，這是植物在逆境下發(fā)生的一種生物抗逆性反應(yīng)。逆境下發(fā)芽苦蕎中各種內(nèi)源酶開始動(dòng)員，其中過氧化氫酶是一種重要的酶類。過氧化氫酶又稱觸酶(Catalase，CAT)，是一類廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶。在植物體內(nèi)，適量的過氧化氫能夠使植物細(xì)胞免受氧化脅迫，但是過氧化氫的含量過高會(huì)導(dǎo)致植物體受到損傷。另一方面，過氧化氫可能是啟動(dòng)衰老或細(xì)胞凋亡的重要因子，甚至是決定因子[2]。CAT能夠很好地控制植物中過氧化氫的含量，從而延緩植物體內(nèi)的細(xì)胞衰老甚至凋亡。監(jiān)測(cè)發(fā)芽苦蕎等植物中的過氧化氫酶活性的變化，具有重要的意義。目前測(cè)定其酶活常用方法有高錳酸鉀滴定法、碘量法、紫外分光光度法。高錳酸鉀滴定法[3]是由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局1985年發(fā)布，1986年實(shí)施的一種較權(quán)威的方法，在實(shí)際運(yùn)用中該方法雖然精確，但工作量大且操作繁瑣。陳曉敏[4]利用碘量法對(duì)切花CAT活性進(jìn)行研究，認(rèn)為碘量法存在著誤差大、重復(fù)性差的的缺點(diǎn)。楊亞平[5]等人利用紫外分光光度法測(cè)定水稻種子內(nèi)CAT活性，認(rèn)為該方法雖重現(xiàn)性好、檢測(cè)線相對(duì)較低，但在測(cè)定底物或產(chǎn)物改變量方面不太準(zhǔn)確。

氧電極具有靈敏度高、測(cè)量時(shí)間短、追蹤氧含量變化準(zhǔn)確、自動(dòng)化控制等特點(diǎn)，目前主要運(yùn)用于測(cè)定植物的光合作用和呼吸作用，用于測(cè)定發(fā)芽植物中過氧化氫酶的活性還未見報(bào)道。本文采用丙酮法提取過氧化氫酶，并使用硫酸銨分級(jí)沉淀的方法對(duì)過氧化氫酶進(jìn)行分級(jí)純化，利用Clark氧電極法探究分級(jí)純化后的過氧化氫酶的最適溫度、pH、底物濃度對(duì)酶活性的影響，建立了氧電極法測(cè)定發(fā)芽苦蕎中過氧化氫酶活的快速簡(jiǎn)便方法。

1 材料與方法

1.1 材料

磷酸、冰丙酮、過氧化氫、硫酸銨、次氯酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純。試驗(yàn)所需的苦蕎產(chǎn)自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市，采購(gòu)后存儲(chǔ)于－20℃的冰柜中備用。

1.2 主要儀器

氧電極儀(英國(guó)Hansatech公司)、低溫循環(huán)水浴鍋(金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠)、恒溫培養(yǎng)箱(北京福意電器有限公司)、HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金成國(guó)勝試驗(yàn)儀器廠)、KDC－160HR高速冷凍離心機(jī)、電動(dòng)勻漿機(jī)、FA2004分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)預(yù)處理

1.3.1 苦蕎的發(fā)芽 將苦蕎種子用去離子水多次清洗，隨后用1%次氯酸鈉溶液浸泡15min。用去離子水將苦蕎種子洗至中性后加去離子水在33℃恒溫水浴鍋中浸泡5h后置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，樣品放置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔8h澆少量的去離子水，保證培養(yǎng)皿濕潤(rùn)，培養(yǎng)至苦蕎芽長(zhǎng)約4～6cm即可避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶液的制備 參照吳紅梅[6]的方法，取發(fā)芽苦蕎100g，加入約－20℃的冰丙酮200mL，用高速組織搗碎機(jī)勻漿5min，4層紗布過濾，混合液用真空抽濾泵抽濾，殘?jiān)磸?fù)用丙酮沖洗，抽濾，直至呈白色粉末，即為丙酮粉。稱取2g丙酮粉，加入40mL 0.1mol/L的磷酸緩沖溶液(pH=7.2)，0℃下在磁力攪拌器中勻漿30min，并在0～4℃高速冷凍離心機(jī)設(shè)置轉(zhuǎn)速2000rpm下離心30min，上清液即為CAT粗酶液。

1.3.3 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀純化[7]在CAT粗酶液中緩慢加入固體硫酸銨粉末至硫酸銨飽和度達(dá)20%，繼續(xù)攪拌20min后，在離心機(jī)中以2000rpm離心15min，所得沉淀用0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH=7.2)溶解備用。上清液繼續(xù)邊攪拌邊加固體硫酸銨至30%的飽和度 ，然后攪拌溶液20min，在離心機(jī)中以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，所得沉淀再用0.1mol/L磷酸緩沖溶液溶解備用，按著上述步驟，分別加至40%、50%的飽和度，攪拌、離心，所得沉淀分別溶于0.1mol/L磷酸緩沖溶液中，在－20℃下冷藏備用。

1.4 試驗(yàn)測(cè)定方法及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 CAT活性的測(cè)定原理 CAT完整的催化機(jī)制還沒有完全被了解，但其催化過程普遍被認(rèn)為分為兩步:

其中，“Fe(Ⅲ)－E”表示為結(jié)合在過氧化氫酶上的血紅素基團(tuán)(E)的中心鐵原子(Fe)。Fe(IV)－E(.+)為Fe(V)－E的一種共振形式，即鐵原子并沒有完全氧化到+V價(jià)，反而從血紅素上接受了一些“支持電子”。從而使反應(yīng)式中的血紅素成為自由基陽(yáng)離子(+)。

過氧化氫進(jìn)入活性位點(diǎn)的同時(shí)并與過氧化氫酶147位上的天冬酰胺殘基(Asn147)和74位上的組氨酸殘基(His74)相互作用，使得原子間互相傳遞一個(gè)質(zhì)子，自由的氧原子配位結(jié)合，生成水分子和Fe(IV)=O。Fe(IV)=O再與下一個(gè)過氧化氫分子反應(yīng)重新形成Fe(III)－E，并生成水分子和氧氣。活性中心鐵原子的反應(yīng)活性可能會(huì)因?yàn)?57位上酪氨酸殘基(Tyr357)的苯酚基側(cè)鏈的存在(幫助Fe(III)氧化為Fe(IV))而得以提高。反應(yīng)的效率可能是通過His74和Asn147與反應(yīng)中間體作用而得以提高[8]。

1.4.2 CAT活性的測(cè)定方法 使用主要成份為氧化鋁的電極清潔劑(Hansatech Instruments)擦拭銀極，直至表面無(wú)氧化層電極光亮，并用蒸餾水清洗殘余的電極清潔劑，棉棒擦拭干。按操作規(guī)程安裝、校正氧電極系統(tǒng)，通過敏感性測(cè)試后即可進(jìn)行樣品測(cè)試。將底物溶液在與測(cè)試溫度相同的水浴鍋中保溫5min，循環(huán)水浴鍋設(shè)置適合的溫度，用一次性滴管吸取1.5ml過氧化氫磷酸緩沖溶液(pH=7.2)于反應(yīng)室中，加入磁力轉(zhuǎn)子，塞上電極塞，攪拌10min。當(dāng)溫度穩(wěn)定后，用微量注射器吸取10ul過氧化氫酶溶液從電極塞的小孔中注入，即可得到耗氧或放氧曲線，選取從加入酶后60s內(nèi)一段斜率比較穩(wěn)定的記錄結(jié)果計(jì)算，得放氧曲線線性方程，斜率即為單位時(shí)間內(nèi)釋放的氧氣含量，定義酶活性的單位為mmol/L·s。

1.4.3 (NH4)2SO4飽和度對(duì)CAT活性影響的測(cè)定 按1.4.2的操作要求，在溫度為30℃下，先往反應(yīng)室中加入0.75mol/L過氧化氫磷酸緩沖溶液(pH=7.2)攪拌后，插上電極，分別加入(NH4)2SO4飽和度為20%、30%、40%、50%的10ul過氧化氫酶提取液進(jìn)行5次測(cè)試，標(biāo)記60s內(nèi)斜率比較穩(wěn)定的記錄結(jié)果并保存記錄。

1.4.4 不同溫度對(duì)CAT活性影響的測(cè)定 0.75mol/L過氧化氫磷酸緩沖溶液(pH=7.2)在分別24℃、28℃、32℃、36℃、40℃的水浴鍋中預(yù)熱5min，按照1.4.2的操作要求，依次加入反應(yīng)室中，并用低溫循環(huán)水浴鍋調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)的溫度，進(jìn)行攪拌后，插上電極，用微量注射器加入10ul過氧化氫酶溶液進(jìn)行5次測(cè)定，標(biāo)記60s內(nèi)斜率比較穩(wěn)定的記錄結(jié)果并保存記錄。

1.4.5 不同pH對(duì)CAT活性影響的測(cè)定 用0.1mol/L磷酸二氫鈉和0.1mol/L磷酸氫二鈉按比例配成pH 為 6.4、6.8、7.2、7.6、8.0 的磷酸緩沖溶液，并加入 30%過氧化氫，使其溶液濃度為 0.75mol/L，在30℃的水浴鍋預(yù)熱5min，測(cè)定不同pH下CAT活性。

1.4.6 不同底物濃度對(duì)CAT活性影響的測(cè)定 將30%過氧化氫與0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH=7.2)配成底物為0.15mol/L、0.30mol/L、0.45mol/L、0.6mol/L、0.75mol/L 的過氧化氫磷酸緩沖溶液，在30℃的水浴鍋預(yù)熱5min，測(cè)定各底物濃度下CAT活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 (NH4)2SO4飽和度對(duì)CAT活性的影響

表1 (NH4)2SO4飽和度對(duì)CAT活性的影響Table 1 The effects of ammonium sulfate saturation on CAT activity

圖1為不同(NH4)2SO4飽和度下氧電極測(cè)定反應(yīng)室中含氧量的變化。將圖1數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，可計(jì)算得到線性方程，其斜率即為酶活性，見表1。由于(NH4)2SO4飽和程度的不同，反應(yīng)釋放的氧氣量不同。隨著(NH4)2SO4飽和度的增加，釋放出氧氣的速率降低，即過氧化氫酶活性降低。(NH4)2SO4飽和度為20%時(shí)，其酶活性最高，比其它濃度高出2～6倍。同時(shí)相比于粗酶液，20%(NH4)2SO4飽和溶液的酶活性高出近2倍，因此20%(NH4)2SO4飽和度為過氧化氫酶進(jìn)行(NH4)2SO4分級(jí)沉淀的最佳濃度。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)CAT活性的影響

表2 反應(yīng)溫度對(duì)CAT活性的影響Table 2 The effects of temperature on CAT activity

圖2為不同溫度下氧電極測(cè)定反應(yīng)室中含氧量的變化。將圖2數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，可計(jì)算得到線性方程及酶活性，見表2。當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，釋放氧氣的速率最大，即為酶活性最高，20℃ ～30℃隨著溫度的增加，酶活性增加，但在20℃ ～25℃之間的酶活性相對(duì)較低，不利于催化反應(yīng)的進(jìn)行，在30℃ ～40℃溫度范圍內(nèi)的酶活性相對(duì)于在20℃ ～25℃溫度范圍內(nèi)的酶活性較高，說明隨著溫度的增加，酶活性變大，但溫度高于30℃，隨著溫度的增加酶活性反而降低，因此當(dāng)反應(yīng)升高溫度可以加快反應(yīng)速率，但反應(yīng)提高到一定溫度時(shí)，反應(yīng)速率反而變慢，30℃為CAT活性測(cè)定的合適溫度。

2.3 pH對(duì)CAT活性的影響

圖3為不同pH的條件下氧電極測(cè)定反應(yīng)室中含氧量的變化。將圖3數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，可計(jì)算得到線性方程及酶活性，見表3。當(dāng)反應(yīng)pH范圍在6.8～7.6時(shí)，釋放氧氣的速率最大，此時(shí)酶活性較高，其中以pH為7.2時(shí)酶的活性最高。當(dāng)pH=8.0時(shí)的酶活性比pH=6.4的酶活性高，但隨著pH的升高，CAT活性不斷降低，在弱堿性的環(huán)境下CAT活性較大，最適的測(cè)定pH為7.2。

表3 pH對(duì)CAT活性的影響Table 3 The effects of pH on CAT activity

2.4 H2O2濃度對(duì)CAT活性的影響

圖4為不同過氧化氫濃度下氧電極測(cè)定反應(yīng)室中含氧量的變化。將圖4數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，可計(jì)算得到線性方程及酶活性，見表4。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.15mol/L～0.75mol/L時(shí)，過氧化氫濃度為0.75mol/L，酶的反應(yīng)速率最大。當(dāng)過氧化氫的濃度較低的時(shí)候其酶的反應(yīng)速率較低，但隨著濃度的增加，酶反應(yīng)速率不斷增加，說明過氧化氫酶分解過氧化氫的同時(shí)，過氧化氫的濃度液影響著酶的分解速度。由圖4的變化趨勢(shì)，0.6～0.75 mol/L是合適的底物濃度區(qū)域。

表4 H2O2濃度對(duì)CAT活性的影響Table 4 The effects of hydrogen peroxide concentration on CAT activity

3 討論

硫酸銨分級(jí)沉淀是利用較高濃度的鹽離子會(huì)與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分，使得蛋白質(zhì)表層親水的水化膜遭到破壞而使蛋白質(zhì)沉淀但不會(huì)變性。研究表明，硫酸銨在高濃度時(shí)抑制蛋白酶活性，隨著硫酸銨濃度的增加，過氧化氫酶活性反而減小，過氧化氫酶的硫酸銨最佳飽和濃度為20%。

朱啟忠[9]對(duì)萌發(fā)棉子的酶活性研究中指出在中低溫(14℃ ～22℃)處理過氧化氫酶，其活性無(wú)明顯差異，高溫(30℃)是室溫處理的1.85倍，差異顯著，效果最佳。本研究中發(fā)芽苦蕎中過氧化氫酶的最適溫度為30℃左右，隨著溫度的增加過氧化氫酶的內(nèi)能增加，活化分子數(shù)目增加，酶活性增強(qiáng)，到30℃酶活性達(dá)到最高，溫度繼續(xù)增加，活性酶的濃度大大降低，但40℃未達(dá)到使蛋白質(zhì)變性的溫度，所以不會(huì)使酶失活，而是使酶活性降低。pH能夠控制CAT分子活性部分有關(guān)的基因是否解離，在CAT最適pH時(shí)，酶分子上的活性基因最適于與底物結(jié)合，pH高于或低于最適pH時(shí)，活性基因的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結(jié)合力降低，使酶的反應(yīng)速率降低。張福平[10]對(duì)佛手瓜中的過氧化氫酶的最佳pH范圍為6.5～8.0，最適pH為7.5。發(fā)芽苦蕎的最佳pH范圍為6.8～7.6，pH=7.2時(shí)酶活性最大，其變化規(guī)律是隨著酸性增加或堿性增加，其酶活性均逐漸減小。

CAT在底物濃度較低時(shí)，隨底物濃度的增加反應(yīng)速率加快，在0.15mol/L～0.75mol/L的過氧化氫濃度區(qū)間內(nèi)，0.15mol/L的過氧化氫酶活性最低，0.75mol/L的過氧化氫酶活性最高。張隨成[11]對(duì)土壤中的過氧化氫酶的進(jìn)行研究指出過氧化氫的最佳濃度為0.741mol/L，發(fā)芽苦蕎中的過氧化氫酶最佳底物濃度接近于土壤中過氧化氫酶的最佳底物濃度，因此在試驗(yàn)底物濃度區(qū)間中，最適底物濃度為0.75mol/L。

理論上，過氧化氫在高溫下易分解，30℃以下最穩(wěn)定，70℃以上反應(yīng)速率更快，在堿性條件下易分解，濃度越高越容易分解，超過濃度65%會(huì)產(chǎn)生較大的危害[12]。商品過氧化氫藥品均加有穩(wěn)定劑，若要過氧化氫分解需超過其活化能，試驗(yàn)溫度控制在25℃ ～40℃的區(qū)間內(nèi)，不會(huì)使過氧化氫大量分解。從pH的角度說，利用磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)試驗(yàn)所需酸堿度，可以減少酸堿度對(duì)過氧化氫的影響，而選用0.15mol/L～0.75mol/L區(qū)間的底物濃度可防止由于過氧化氫濃度過高而導(dǎo)致過氧化氫分解，綜上所述，試驗(yàn)過程可排除過氧化氫對(duì)試驗(yàn)的影響。

4 結(jié)論

(NH4)2SO4分級(jí)沉淀能夠使過氧化氫粗酶液的酶濃度增加，達(dá)到提純的效果，最適飽和度為20%，隨著飽和度的增高，酶活性減小。研究表明，CAT活力測(cè)定最適溫度為30℃，最適溫度范圍為30℃ ～40℃。CAT適宜偏中性環(huán)境，pH低于6.8或高于7.6的酶活性逐漸降低，在pH6.8～pH7.6之間酶活性最好，且最佳pH為7.2。當(dāng)H2O2濃度較低時(shí)，過氧化氫酶會(huì)隨著過氧化氫的濃度升高而變大，0.6～0.75 mol/L是合適的底物濃度區(qū)域。用氧電極測(cè)CAT活性能夠很好的控制溫度等條件，靈敏度高，方便快捷，是一種值得推廣的方法。

[1]郎桂常.苦蕎麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其開發(fā)應(yīng)用[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，1996，11(3):10－11.

[2]南芝潤(rùn)，范月仙.植物過氧化氫酶的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，14(5):27－29.

[3]王華芳，展海軍.過氧化氫酶活性測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2009(19):7－8.

[4]陳曉敏.測(cè)定切花中過氧化氫酶活性的3種常用方法的比較[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，33(5):13－15.

[5]楊亞平，姜孝成，陳良碧，等.水稻種子老化的生理機(jī)制[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，34(3):265－268.

[6]李立祥，吳紅梅.提取方法對(duì)茶多酚氧化酶活性的影響[J].中國(guó)茶葉加工，2001(4):30－31.

[7]程宇，程珂，陳力宏，等.不同方法制備馬鈴薯蛋白的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)研究[J].食品科技，2015，40(2):229－230.

[8]李欽，張樹政.氧電極及其在生物化學(xué)分析中的應(yīng)用[J].化學(xué)通報(bào)，1982(6):23－28.

[9]宋淑淑，朱啟忠.不同條件下殼聚糖對(duì)棉子萌發(fā)及相關(guān)酶活性的影響[J].中國(guó)棉花，2012(7):18－20.

[10]張福平，何秀娟，張秋燕.不同因素對(duì)佛手瓜過氧化氫酶活性的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(6):47－49.

[11]羅澤嬌，張隨成.簡(jiǎn)易氣量法測(cè)試土壤過氧化氫酶活性的研究[J].地質(zhì)科技情報(bào)，2005，24(4):87－90.

[12]許志忠，李曉春.過氧化氫分解影響因素分析[J].染整技術(shù)，2006，28(1):33－36.