董金星,楊夢嬌,陳小芳,周亞林,周金燕,陶雅圓,崔杰玉,謝 越
(安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)
EM菌是主要菌種是以乳酸菌、光合細(xì)菌、酵母菌、乙酸菌為主的微生物復(fù)合而成的一種微生活菌制劑[1],其作為功能性微生物已經(jīng)用于養(yǎng)殖業(yè)、漁業(yè)、污水及廢棄物處置等多個方面[2],但如何使用適當(dāng)?shù)妮d體使EM菌充分發(fā)揮功效一直是研究的難點(diǎn)。生物炭是生物質(zhì)在缺氧和相對溫度“較低”(<700℃)條件下熱解形成的產(chǎn)物[3-4],主要由有芳香烴和單質(zhì)炭或具有石墨結(jié)構(gòu)的炭組成,含有60%以上的碳元素,其作為肥料緩釋載體、土壤改良劑、污染物修復(fù)、減少碳排放量等方面近些年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[5-6]。生物炭孔隙度發(fā)達(dá)和比表面積巨大,可以作為優(yōu)良的功能性微生物載體[7]。但生物炭作為EM菌的功能性微生物載體方面的研究卻鮮見報道,本試驗研究了生物炭作為EM菌載體的承載能力,利用平板計數(shù)法對其進(jìn)行研究,優(yōu)化生物炭投加量、菌液濃度、振蕩時間、吸附溫度等關(guān)鍵影響因子,探討生物炭作為功能性微生物載體的可行性和最佳條件。
生物炭:所用生物炭為自制稻殼生物炭,將稻殼放入剛玉坩堝內(nèi)壓緊加蓋,用鋁箔紙包裹嚴(yán)實(shí)后放入馬弗爐內(nèi),500℃下烘制2h,即制得稻殼生物炭[8]。EM 菌培養(yǎng)基組成為:紅糖100g,尿素1g,NaCl 1g,1L蒸餾水,溶解后調(diào)整pH至7.0±0.2。平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基組成:胰蛋白胨5.0g,酵母浸膏2.5g,葡萄糖1.0g,瓊脂15g,1L 蒸餾水,溶解后調(diào)整 pH7.0 ±0.2,分裝錐形瓶后,121℃高壓滅菌滅菌15min[9]。無菌生理鹽水:取8.5g NaCl溶于1L蒸餾水中,121℃高壓滅菌滅菌15min。EM菌種采購自河南中廣集團(tuán),菌種為黃褐色干粉狀復(fù)合型菌劑,由雙岐菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌、放線菌、醋酸菌等組成。紅糖購于安徽省鳳陽縣某超市;尿素、NaCl、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂等藥劑均為分析純。HZ500L恒溫?fù)u床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司);GI54T高壓滅菌鍋(ZEALWAY);DNP-9272-1A恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。
1.2.1 制備待測EM菌液 將EM菌種干粉接種于EM菌培養(yǎng)基,置于密閉塑料瓶中,36±1℃、200 r/min,每日放氣一次,振蕩培養(yǎng)48 h,即為活化EM菌液。再將活化EM菌液與EM培養(yǎng)基以體積比1∶19的比例,36℃恒溫、160 r/min振蕩,每日開蓋放氣一次,振蕩培養(yǎng)72h后即為待測EM菌液。
1.2.2 不同生物炭投加量對 EM 菌吸附效果的影響 各取 0.40g、0.80g、1.20g、1.60g、2.00g、2.40g 生物炭,另取0g記為CK,加入250mL三角燒瓶內(nèi),分別加入10mL待測EM菌液和90mL無菌水,25℃、160 r/min振蕩30min,取上清液測定EM菌CFU值,以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值,測定方法見1.2.6。每個處理做3個重復(fù)。
1.2.3 生物炭對不同濃度EM菌吸附效果的影響 各取10mL待測EM菌,分別稀釋2倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍,加入2g生物炭,另取0g記為CK,加入250mL三角燒瓶內(nèi),分別加入10mL待測EM菌液和90mL無菌水,25℃、160 r/min振蕩30min,取上清液測定EM菌CFU值,以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值,測定方法見1.2.6。每個處理做3個重復(fù)。
1.2.4 不同振蕩時間生物炭對EM菌吸附效果的影響 各取10mL待測EM菌、40mL無菌水,分別加入6 個250mL 三角燒瓶內(nèi),加入2g生物炭,25℃、160 r/min 振蕩 0min、30min、60min、90min、120min、150min,另取0g記為CK,加入250mL三角燒瓶內(nèi),取上清液測定EM菌CFU值,以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值,測定方法見1.2.6。每個處理做3個重復(fù)。
1.2.5 不同溫度下生物炭對EM菌吸附效果的影響 各取10mL待測EM菌、40mL無菌水,分別加入5個250mL三角燒瓶內(nèi),加入2g生物炭,分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃,160 r/min振蕩60min,另取0g記為CK,加入250mL三角燒瓶內(nèi),取上清液測定EM菌CFU值,以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值,測定方法見1.2.6。每個處理做3個重復(fù)。
1.2.6 EM菌CFU值測定方法 在超凈工作臺內(nèi)以無菌操作將待測樣取1mL用無菌生理鹽水稀釋至104、105兩個稀釋倍數(shù),各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi),每皿加入15mL~20mL尚未凝固的平板計數(shù)瓊脂,混勻,凝固后在瓊脂表面再覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基(約4mL),凝固后翻轉(zhuǎn)平板,36±1℃培養(yǎng)48h±2h后記錄稀釋倍數(shù)和相對應(yīng)的菌落數(shù)量,即為菌落形成單位(以CFU表示)。
在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上,以生物炭投加量、EM菌濃度、振蕩時間、吸附溫度4個條件作為參考因素,設(shè)計正交設(shè)計因素與水平考察,見表1。
表1 正交設(shè)計因素與水平考察表Table 1 Orthogonal design factor and level survey
數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成。
2.1.1 投加生物炭量的確定 試驗1設(shè)計單因素變量為生物炭投加量,加入不同重量生物炭吸附處理后,取上清液稀釋至合適倍數(shù),分別接入計數(shù)培養(yǎng)基,經(jīng)過48h培養(yǎng)后進(jìn)行CFU計數(shù),從圖1可知,生物炭吸附的EM菌的數(shù)量隨著生物炭的增加而增加,加入2.4g生物炭吸附的EM菌CFU數(shù)量最多,達(dá)到2.9×107CFU,相比投加量為0.4g時吸附的EM菌數(shù)量增加了93.3%,生物炭投加量與EM菌吸附量呈正相關(guān)性。當(dāng)生物炭投加量0.4g時,其吸附的CFU數(shù)為1.5×107CFU,但當(dāng)投加量增加一倍至0.8g時,其吸附的CFU僅為1.7×107CFU,增幅僅為13.3%。根據(jù)圖2可知,單位生物炭吸附效果最好的是加入0.4g時,其吸附量為3.8×107CFU/g。隨著生物炭投加量的增加,單位生物炭吸附量在投加至2.4g時逐漸減少為1.2×107CFU/g。由投加量0.4g增加至0.8克時,其單位生物炭吸附量大幅降低43.3%,但此后降幅顯著減小,當(dāng)投加量從2.0g提升至2.4g時,單位生物炭吸附量僅降低7.1%,生物炭投加量與單位生物炭吸附量呈負(fù)相關(guān)。
2.1.2 菌液濃度確定 試驗2設(shè)計單因素變量為不同濃度EM菌,原EM菌液濃度為4.5×107CFU/mL,加入不同倍數(shù)純水稀釋處理后,取上清液稀釋至合適倍數(shù),分別接入計數(shù)培養(yǎng)基,經(jīng)過48h培養(yǎng)后進(jìn)行CFU計數(shù)。由圖3可知,生物炭吸附效果最好的是稀釋2倍,生物炭可吸附的EM菌達(dá)到2.3×107CFU/g,隨著菌液濃度的降低吸附效果降低,當(dāng)稀釋至20倍時,生物炭吸附量僅0.3×107CFU/g,僅為稀釋2倍時的10%。稀釋倍數(shù)與EM菌吸附量呈負(fù)相關(guān)。劉慶莉[10]等人研究根瘤菌在草炭和蛭石作為載體試驗中發(fā)現(xiàn),以草炭和蛭石作為根瘤菌載體,低濃度的根瘤菌液接入更能發(fā)揮作用,而以液體作為根瘤菌載體,根瘤菌接入濃度較高才能發(fā)揮作用。
2.1.3 振蕩時間的確定 從圖4可知,試驗3設(shè)計單因素變量為不同振蕩時間,當(dāng)振蕩時間為0min時,吸附EM菌僅為0.3×107CFU/g,150min生物炭吸附的EM菌已達(dá)到2.9×107CFU/g,振蕩30min較振蕩0min生物炭吸附的EM菌增加了463%,但隨著振蕩時間的增加,振蕩90min后吸附量增加已不顯著,振蕩150min較振蕩120min吸附量僅增加3.2%,振蕩120min較振蕩90min吸附量僅增加4.5%。其原因是生物炭表層有著大量多空隙結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu)的官能團(tuán),孔道效應(yīng)也較明顯,利于吸附過程的進(jìn)行。在吸附過程初期,吸附效率較為迅速,但隨著吸附時間增加,EM菌大量聚集在生物炭的微孔和表面,使得生物炭吸附位不斷減小,因此吸附速率逐漸降低。此前已有許多學(xué)者對振蕩吸附時間作過研究,沈巖柏[11]等人研究當(dāng)吸附載體為硅藻土?xí)r,振蕩20min時已達(dá)穩(wěn)定狀態(tài),馬萬征[12]等研究當(dāng)活性炭吸附含鉻廢水時,150min可達(dá)穩(wěn)定狀態(tài),而戴世華[13]等人研究的使用活性炭脫色工藝研究在70min即可達(dá)到最佳。本研究與其可能由于試驗載體材質(zhì)的不同,振蕩90min后基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
2.1.4 吸附溫度的確定 試驗4單因素變量為不同吸附溫度,從圖5可知,當(dāng)吸附溫度為15℃時,生物炭吸附的EM菌僅為1.8×107CFU/g,當(dāng)吸附溫度上升至35℃時,生物炭吸附量達(dá)最大值2.6×107CFU/g,生物炭吸附量提高了44.4%。但當(dāng)吸附溫度上升至40℃時,生物炭吸附量降低為2.3×107CFU/g,降幅為11.5%,其原因可能為有部分EM菌超過35℃后開始死亡。此前許多學(xué)者對吸附溫度與吸附量對菌群的影響進(jìn)行研究,沈巖柏[12]等人的研究硅藻土對諾卡氏菌的吸附作用,室溫下即可達(dá)到較好的吸附效果,但與趙穎[14]等人研究EM菌則在35℃時生長狀態(tài)最佳,其原因可能因載體或菌種不同其對吸附溫度產(chǎn)生的差異表現(xiàn)。
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,并考慮到在實(shí)際應(yīng)用過程中對EM菌群最大總吸附數(shù)量的要求,選取1.6g、2.0g、2.4g作為正交試驗3個因素水平;選取稀釋2倍、稀釋4倍、稀釋5倍作為正交試驗的個因素水平;選取60min、90min、120min作為正交試驗3個因素水平,選擇30℃、35℃、40℃作為正交試驗的3個因素水平,以正交因子水平表設(shè)計正交實(shí)驗表L9(34),見表2。
表2 正交試驗結(jié)果表Table 2 Orthogonal experimental results tables
由表2的極差分析可知,4個因素中對生物炭吸附EM菌效果的影響大小主次順序依次為:A>B>C>D,即生物炭投加量(A)>菌液濃度(B)>振蕩時間(C)>吸附溫度(D),生物炭投加量和菌液濃度對生物炭吸附EM菌影響較大。由正交試驗K值可推導(dǎo)出,最優(yōu)吸附條件為A3B1C3D3,但與正交試驗表中最優(yōu)吸附條件A3B1C3D2不相符,對組合A3B1C3D3進(jìn)行重復(fù)試驗,其吸附的生物炭為3.8×107CFU/g,大于正交試驗中組合A3B1C3D2的3.6×107CFU/g,因此生物炭吸附EM菌最佳吸附條件為A3B1C3D3,即生物炭投加量2.4g、菌液稀釋倍數(shù)2倍、振蕩120min、吸附溫度40℃、生物炭吸附的CFU值最高達(dá)到3.8×107CFU/g。
目前對生物炭吸附重金屬的研究較多,但對其作為吸附EM菌的載體研究鮮見報道。本文研究生物炭作為EM菌載體,生物炭投加量、菌液濃度、振蕩時間、吸附溫度等四個影響因素對其吸附效果的影響,獲得如下結(jié)論:生物炭對EM菌有良好的吸附效果,生物炭吸附EM菌量與生物炭投加量呈正相關(guān),但其吸附效率與生物炭投加量呈負(fù)相關(guān);與EM菌的濃度呈正相關(guān);與菌液稀釋倍數(shù)呈負(fù)相關(guān);與振蕩吸附時間呈正相關(guān),與吸附溫度在15℃到35℃內(nèi)呈正相關(guān),但溫度達(dá)到40℃吸附效率有所降低。根據(jù)正交實(shí)驗結(jié)果可知,生物炭吸附EM菌主要影響因素為生物炭投加量>菌液濃度>振蕩時間>吸附溫度;吸附10mL濃度為4.5×107CFU/mL的EM菌液其最佳條件為生物炭投加量2.4g、菌液稀釋倍數(shù)2倍、振蕩120min、吸附溫度40℃。本研究結(jié)果揭示了生物炭可以作為EM菌劑優(yōu)良載體,具有潛在應(yīng)用價值。
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