安徽省赤練蛇野生群體遺傳多樣性分析

鮑方印，肖明松，王松華，何慶元

(安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

赤鏈蛇(Dinodon rufozonatum)屬爬行綱、蛇目、游蛇科，是一種國內(nèi)分布廣泛的后溝牙類毒蛇[1]。該物種已被列入中國國家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的陸生野生動物名錄》[2]。赤鏈蛇在臨床應(yīng)用上有治療慢性結(jié)核性瘺管的作用，藥理上有抗炎、鎮(zhèn)痛、催眠、鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用，有一定的醫(yī)學(xué)研究價值[3]。關(guān)于赤鏈蛇的研究，早期主要集中在地理分布、生態(tài)習性、藥用價值等方面，近期深入到生理生化和分子水平，如陳壁輝報道了赤鏈蛇的棲息環(huán)境、活動和捕食習性，蔡亞非等[4]發(fā)現(xiàn)赤鏈蛇達氏腺內(nèi)與特有取食習慣的關(guān)系，張蕾等[5]研究了赤鏈蛇的消化道中嗜銀細胞分布、細胞形態(tài)和功能，楊超等采用RT－PCR技術(shù)研究了赤鏈蛇不同組織Sox基因的表達[6]，但關(guān)于赤鏈蛇目前的資源現(xiàn)狀和遺傳多樣性的研究卻很少見報道。線粒體DNA(mtDNA)具有分子小、結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、進化速度快、幾乎不發(fā)生重組、不同區(qū)域進化速度存在差異等特點，是一個相對獨立的復(fù)制單位，已被廣泛地應(yīng)用于類群識別、地理隔離、起源、分化和擴散、遺傳多樣性等領(lǐng)域[7－8]。本文利用mtDNA控制區(qū)序列對安徽省赤鏈蛇野生群體進行遺傳分析，研究赤鏈蛇的系統(tǒng)發(fā)育和地理分布規(guī)律，為赤鏈蛇野生種群的保護和開發(fā)利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

赤鏈蛇樣本14個，分別來自淮北、江淮、皖西、皖南和沿江等5個地區(qū)的6個種群，具體見表1。標本采用95%乙醇固定，－20℃保存。

表1 赤鏈蛇樣本編號及采集地Table 1 Names and resources of tested samples

1.2 DNA提取、PCR擴增和序列測定

改良苯酚氯仿抽提法，從每個樣本的肌肉組織中經(jīng)勻漿、裂解、消化提取、純化，得到基因組DNA，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)總體積為30μL，其中含10×buffer反應(yīng)緩沖液3.0 μL，3μL dNTP(2.5mmol/L)，0.4μmol/L 引物，0.25 μL Taq酶，25ng DNA，用滅菌雙蒸餾水補足體積。94 ℃下預(yù)變性 5 min，94 ℃下變性30s，58℃下退火1min，72℃下延伸1 min，72℃下延伸10min，4℃保存。擴增產(chǎn)物在 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照、保存。產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行序列測定，測得的序列用Clustal X 1.81程序[9]進行比對，并輔以人工校對，進行同源性比較。

1.3 統(tǒng)計分析

采用CLUSTALw軟件將測序結(jié)果進行對位排序，用分子進化遺傳分析軟件MEGA4.0軟件計算不同序列間的堿基替代數(shù)、變異位點、簡約信息位點數(shù)、顛換百分比、轉(zhuǎn)換/顛換比率和Kimura兩參數(shù)(2 parameter)距離[13];用DNASTAR4.0軟件計算兩兩序列的遺傳相似度和序列差異百分比。通過MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ樹，在重建系統(tǒng)發(fā)生樹時，去除兩兩對位序列中的缺失，應(yīng)用自舉法(Bootstrap)評估系統(tǒng)樹[11]。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA D－Loop序列及其變異

測定了來自6個種群的14個赤練蛇樣本，結(jié)果D－Loop序列的長為690bp，經(jīng)序列核對及氨基酸轉(zhuǎn)換，沒有缺失或插入。同時，在所有序列中共發(fā)現(xiàn)6個不同的單倍型(表2)。在這6個序列中，共有24個位點呈現(xiàn)變異，其中13個簡約信息位點。在所有的序列中，堿基組成的百分比中顯示了G的相對缺乏，A+T的平均含量為60.2%，而C+G的平均含量為39.8%。核苷酸堿基的變異也存在很大差異，其中T－C的轉(zhuǎn)換比A－G轉(zhuǎn)換發(fā)生的多，顛換中只有A與T之間的顛換發(fā)生，沒有A與C、C與G和G與T之間的顛換。

表2 赤鏈蛇D－Loop序列堿基組成頻率(%)Table 2 Frequencies of base composition in the D－Loop gene fragments of Dinodon rufozonatum(%)

2.2 分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建

在Kimura雙參數(shù)距離中，所有6個單倍型間的數(shù)值在0.0016－0.1024，平均距離是0.0276。在序列差異百分比表中，所有單倍型間的數(shù)值在0.5% －0.8%，平均為0.66%，(見表3)。通過MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ樹(圖1)，安徽省野生赤鏈蛇分為3個分支，皖南、皖西各一支，沿江、江淮和淮北為另一支。

表3 赤鏈蛇群體間D－Loop序列不同單倍型的雙參數(shù)距離(對角線下)和序列差異百分比(對角線上)Table 3 Kimura 2－parameter distance(below diagonal)and percent difference(above diagonal)for different hapotypes on D－Loop sequences of Dinodon rufozonatum

3 討論

6個赤鏈蛇野生種群之間的序列差異百分比在0.5%到0.8%之間，在mt DNA堿基替換中存在轉(zhuǎn)換偏奇，隨著進化時間的增加，顛換的積累，轉(zhuǎn)換偏奇會下降;同時，一般認為轉(zhuǎn)換顛換的比值小于2.0時，則此基因序列的突變已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，受進化噪音的影響可能性較大。對赤鏈蛇野生種群的研究也說明了分歧時間越長、親緣關(guān)系越遠的分類單元之間，核苷酸發(fā)生顛換的頻率越高，即親緣關(guān)系較近的物種之間總是有更高的轉(zhuǎn)換差異比例;同時，赤鏈蛇野生種群之間的偏奇可能會隨著進化時間的增加和空間隔離的加劇而下降，而它們之間的突變因受到多重替換和飽和效應(yīng)的影響而達到飽和。

一般認為，置信水平值(BCL)高于70%的分支為可信[11]。從構(gòu)建的系統(tǒng)樹上充分反映了皖南種群和皖西種群之間的遺傳距離最遠，而淮北、江淮和沿江種群之間距離適中。所以考慮到赤鏈蛇在安徽的分布現(xiàn)狀和各地理種群的分布情況，將這6個地理種群分為3系。赤鏈蛇的遺傳分化呈現(xiàn)出地理區(qū)域上的連續(xù)性。Barber等認為地理障礙與氣候特征的差異在種系地理學(xué)結(jié)構(gòu)的形成過程中可能起到了非常重要的作用。作者在進行安徽省的赤鏈蛇資源現(xiàn)狀調(diào)查時參考陳壁輝等對安徽地理分布區(qū)的劃分，采集的標本包括淮北、江淮、沿江、皖西和皖南5個地區(qū)，但江淮地區(qū)選取了蚌埠荊山和滁州皇甫山的標本，雖然同屬一個地理區(qū)劃，但種群之間也出現(xiàn)了差異。沿江江北、皖南、皖西3系的分化與山脈形成的地理隔離有關(guān)。而長江與淮河的隔離作用不大，遷徙能力較強的赤鏈蛇進入同一地域中可能發(fā)生一定的基因交流。同時，隨著經(jīng)濟、交通的發(fā)展和偷獵走私的日益猖獗，使爬行動物有機會進入其他分布區(qū)，也進一步導(dǎo)致了各個地理種群遺傳結(jié)構(gòu)的變化。

[1]趙爾宓，黃美華，宗愉.中國動物志(爬行綱，第三卷)[M].北京:科學(xué)出版社，1998.

[2]國家林業(yè)局.國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的陸生動物名錄[J].野生動物，2000，21(5):49－82

[3]陳仁壽.淺析《本草綱目》蛇的藥用[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，16(5):309－310

[4]蔡亞非，劉兆斌，張利軍，等.赤鏈蛇達氏腺內(nèi)分泌細胞免疫細胞化學(xué)[J].解剖學(xué)雜志，2004，27(2):184－187.

[5]張蕾，李淑蘭.赤鏈蛇(Dinodon rufozonatum)消化道嗜銀細胞的分布及形態(tài)學(xué)觀察[J].哈爾濱師范大學(xué):自然科學(xué)學(xué)報，2009，25(1):77 －79.

[6]楊超，楊傳秀，聶劉旺.赤鏈蛇不同組織Sox基因表達的RT－PCR分析[J].激光生物學(xué)報，2004，13(5):334－338.

[7]Kyle C J，Wilson C C.Mitochondrial DNA identification of game and harvested freshwater fish species[J].Forensic science international，2007，166(1):68 －76.

[8]Teletchea F.Molecular identification methods of fish species:reassessment and possible applications[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries，2009，19:265 －293.

[9]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997(24):4876 －4882.

[10]Kumar S，Tamura K，Nei M.Mega 3.0:Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence A-lignment[J].Briefings in Bioinformatics，2004(5):150 － 163.

[11]Rozas J，Sánchez del Barrio J C，Messeguer X，et al.DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J].Bioinformatics，2003(19):2496 －2497.