特殊冷凝集標(biāo)本對(duì)血細(xì)胞分析儀的影響及篩選方法

張俊峰 王彥春 魏殿軍

冷凝集是指患者血液中含冷凝集素，當(dāng)?shù)陀谀硞€(gè)溫度時(shí)血細(xì)胞發(fā)生凝集，當(dāng)溫度恢復(fù)到37℃時(shí)，凝集消失，這種可逆的現(xiàn)象稱為冷凝集現(xiàn)象。隨著血液分析儀的更新?lián)Q代、檢測(cè)準(zhǔn)確度的不斷提高以及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的規(guī)范使得血常規(guī)的復(fù)檢率很低。對(duì)門診量較大的醫(yī)院，血常規(guī)常采用即采即測(cè)的方式，當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果明顯異常時(shí)，可能是標(biāo)本出現(xiàn)冷凝集現(xiàn)象，一般認(rèn)為重新采血后立即上機(jī)檢測(cè)可以排除冷凝集素的干擾，但筆者在工作中仍發(fā)現(xiàn)3例“即采即凝”（血液離體后即發(fā)生凝集，立即上機(jī)檢測(cè)結(jié)果異常，但凝塊要在數(shù)分鐘后才會(huì)出現(xiàn)）的冷凝集標(biāo)本。此類標(biāo)本在門診很容易漏檢，特別是當(dāng)采血管管壁呈細(xì)顆粒狀時(shí)，外觀與正常血相似，不容易發(fā)現(xiàn)異常，而且本文研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱水浴處理后的某些標(biāo)本仍能對(duì)不同血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。在實(shí)際工作中，雖然此類標(biāo)本很少，但若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)，容易發(fā)出錯(cuò)誤的報(bào)告，影響臨床診療，甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重的醫(yī)療事故，因此需引起重視。本文對(duì)我院3例冷凝集標(biāo)本的檢測(cè)處理方法進(jìn)行總結(jié)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集3例即采即凝的血液標(biāo)本，其中2例為我院門診檢測(cè)血常規(guī)的患者，1號(hào)標(biāo)本來(lái)自男性患者，2號(hào)標(biāo)本來(lái)自女性患者，年齡為40～50歲；另1例為我院在社區(qū)義診時(shí)檢測(cè)血常規(guī)的女性患者，68歲，自述多次檢查RBC數(shù)偏低。3例標(biāo)本均無(wú)脂血、溶血、黃疸，且排除其他特征性疾病。

1.2 儀器與試劑 采用日本SYSMEX 800i和SYSMEX XN－2000自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑，邁瑞B(yǎng)C－3000血細(xì)胞分析儀及配套試劑檢測(cè)WBC、RBC、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、平均紅細(xì)胞容積（mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin contentration，MCHC）和血小板（platelet，PLT）；采用 OLYMPUS CX21雙目顯微鏡進(jìn)行WBC、RBC和PLT計(jì)數(shù)。儀器使用前均已校準(zhǔn)，測(cè)定配套質(zhì)控物，結(jié)果也均在靶值允許的范圍內(nèi)。

1.3 方法

1.3.1 儀器法 采用EDTA－K2抗凝劑的真空采血管于肘靜脈處采集靜脈血2 ml，混勻后立即用SYSMEX 800i血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室溫度恒定在25℃。首先，標(biāo)本檢測(cè)完后放在37℃水浴，30 min后觀察未發(fā)現(xiàn)管內(nèi)壁有凝集顆粒，混勻后立即上機(jī)檢測(cè)，其次，對(duì)于結(jié)果異常的標(biāo)本分別用SYSMEX 800i，SYSMEX XN2000和邁瑞 BC－3000血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格保溫。每種儀器重復(fù)做3次，取平均值。

1.3.2 手工法 嚴(yán)格按照《臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》第2版［1］操作規(guī)程分別對(duì)RBC、WBC、PLT進(jìn)行計(jì)數(shù)。37℃水浴30 min后同時(shí)制備血涂片3張，推片后立即置于37℃烘箱內(nèi)烘干，采用瑞氏染色進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)［2］，載玻片也應(yīng)提前進(jìn)行預(yù)熱。

1.4 冷凝集素滴度測(cè)定 用生理鹽水將血漿在32孔板上依次做 1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32…倍比稀釋，每孔 200 μl，并于各孔加4%的自身RBC懸液50μl，置4℃冰箱過(guò)夜，取出后輕輕搖動(dòng)，觀察有無(wú)RBC凝塊。若無(wú)凝塊判為陰性，有凝塊判為陽(yáng)性，并報(bào)告無(wú)凝塊時(shí)的最高稀釋倍數(shù)。

1.5 MCH、MCHC 的計(jì)算 采用 Laboman EasyAcess6.0 軟件對(duì)MCH、MCHC進(jìn)行分析，MCH、MCHC的計(jì)算公式如下。

MCH＝Hb／RBC

MCHC＝Hb／HCT＝Hb／MCV×RBC

當(dāng)發(fā)生冷凝集時(shí)，RBC諸多參數(shù)會(huì)受到影響，由于MCV可能升高，也可能正常；Hb相對(duì)恒定，MCH、MCHC變化較為明顯且能體現(xiàn)RBC參數(shù)的基本信息，因此以MCH、MCHC為代表進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

表1 3例標(biāo)本水浴前后SYSMEX 800i檢測(cè)結(jié)果

表2 3種儀器與手工鏡檢法對(duì)3號(hào)標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果比較

2.1 3例冷凝集標(biāo)本對(duì)同種血液分析儀的影響 由表1可見(jiàn)，3例冷凝集標(biāo)本經(jīng)熱水浴后，1號(hào)標(biāo)本和2號(hào)標(biāo)本的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均恢復(fù)正常；3號(hào)標(biāo)本的RBC和PLT參數(shù)恢復(fù)正常，而WBC較水浴前有所降低。3例標(biāo)本RBC聚集形成的凝塊大小均隨滴度的增加有增大的趨勢(shì)。3號(hào)標(biāo)本因冷凝集素對(duì)WBC產(chǎn)生不同影響，故選用不同血液分析儀進(jìn)行分析。

2.2 不同血液分析儀對(duì)3號(hào)冷凝集標(biāo)本檢測(cè)的比較 以手工鏡檢法為標(biāo)準(zhǔn)，三種儀器檢測(cè)結(jié)果與手工鏡檢法結(jié)果分別進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，3種儀器的PLT與手工鏡檢法結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別，而邁瑞 BC－3000和SYSMEX 800i的 NEUT%及LYMPH%的檢測(cè)結(jié)果與手工鏡檢法有所不同，邁瑞B(yǎng)C－3000的RBC偏低，而SYSMEX 800i的WBC偏高。SYSMEX XN 2000的RBC、WBC、NEUT%和LYMPH%結(jié)果與手工鏡檢法結(jié)果基本一致，見(jiàn)表2。

2.3 3號(hào)標(biāo)本水浴后三種儀器直方圖與散點(diǎn)圖的比較 邁瑞B(yǎng)C－3000的RBC偏低且RBC直方圖的右側(cè)有一個(gè)小波峰，而其他兩臺(tái)儀器并沒(méi)有出現(xiàn)，說(shuō)明RBC檢測(cè)過(guò)程中又重新發(fā)生了聚集，記錄該實(shí)驗(yàn)室室溫為18℃（該患者為社區(qū)義診時(shí)發(fā)現(xiàn)的，該實(shí)驗(yàn)室儀器為邁瑞 BC－3000）；SYSMEX 800i的WBC計(jì)數(shù)偏高，散點(diǎn)圖顯示異常；SYSMEX XN2000的WDF和WNR散點(diǎn)圖完整清晰，見(jiàn)圖1～圖3。

2.4 顯微鏡濕片觀察法檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的結(jié)果 將3號(hào)標(biāo)本推片后立即在顯微鏡下觀察，可以看到均勻的血細(xì)胞逐漸分裂開(kāi)并以各自的中心聚集，各個(gè)細(xì)胞團(tuán)之間仍存在散在的單個(gè)細(xì)胞，見(jiàn)圖4。

2.5 MCH、MCHC的檢測(cè)結(jié)果 用SYSMEX NX2000自帶的Laboman EasyAcess6.0軟件對(duì)我院2013年11月到2014年5月期間SYSMEXNX－2000上的15 474份血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩查性分析。當(dāng)結(jié)果過(guò)濾條件設(shè)置為MCH＞48 pg（超過(guò)上限值的50%）時(shí)仍有5例，而某些透析的患者M(jìn)CH可達(dá)50 pg以上，無(wú)特異性；當(dāng)設(shè)置為MCHC＞400 g／L（超過(guò)上限值的10%）時(shí)，僅有待篩查的冷凝集標(biāo)本與之吻合。

圖1 邁瑞B(yǎng)C－3000檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的血細(xì)胞直方圖

圖2 SYSMEX 800i檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的血細(xì)胞直方圖和WBC散點(diǎn)圖

3 討論

圖3 SYSMEX XN2000檢測(cè)3號(hào)標(biāo)本的WDF、WNR散點(diǎn)圖和RBC、PLT直方圖

圖4 顯微鏡濕片觀察法觀察3號(hào)標(biāo)本的血細(xì)胞狀態(tài)（×400，瑞氏染色）

目前，冷凝集現(xiàn)象的報(bào)道已較為常見(jiàn)，如何解決冷凝集對(duì)血常規(guī)檢測(cè)的影響，在以往的研究中多偏向于熱水浴的方法，本實(shí)驗(yàn)中有3例冷凝集標(biāo)本，1例經(jīng)熱水浴后并不能完全解決問(wèn)題，這與以往的報(bào)道［3］相一致。3號(hào)標(biāo)本對(duì)3種不同儀器的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生不同的影響，這可能與不同儀器的檢測(cè)原理和所受的干擾因素不同有關(guān)。①邁瑞B(yǎng)C－3000無(wú)論重新采血還是熱水浴后，RBC均偏低且RBC直方圖的右側(cè)有一個(gè)小波峰，而其他兩臺(tái)儀器并沒(méi)有出現(xiàn)，說(shuō)明RBC經(jīng)溫度較低的進(jìn)樣針、反應(yīng)器、檢測(cè)器時(shí)又重新發(fā)生了聚集，這與室溫有關(guān)，可見(jiàn)保證實(shí)驗(yàn)室溫度很重要［4］。而WBC在分類時(shí)也發(fā)生錯(cuò)誤，這與三分類分析儀的分類原理有關(guān)。冷凝集素不僅可以凝集RBC，也可凝集WBC和PLT［5］。冷凝集素通過(guò)影響WBC大小而影響其分類。邁瑞B(yǎng)C－3000作為三分類分析儀的代表仍廣泛使用于一級(jí)醫(yī)院，除直方圖外可供參考的信息較少，很容易誤診漏診。②SYSMEX 800i采用核酸熒光染色和前向散色光兩種方法同時(shí)對(duì)WBC進(jìn)行計(jì)數(shù)，WBC計(jì)數(shù)偏高主要與RBC膜質(zhì)溶解不全有關(guān)［6］；③SYSMEX XN2000采用雙熒光染料、3R復(fù)檢規(guī)則、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，從而保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)更精密的儀器由于方法學(xué)上的先進(jìn)性使其受干擾的因素少，從而結(jié)果準(zhǔn)確性更高［7］。

本文研究認(rèn)為即采即凝標(biāo)本的發(fā)現(xiàn)要比解決冷凝集素干擾更具有臨床意義，而冷凝集標(biāo)本的判定不能僅從肉眼對(duì)標(biāo)本的外觀來(lái)判斷，應(yīng)選擇一種有效的篩查方法最大范圍的避免臨床的誤診漏診。由于SYSMEX XN2000的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好，所以用其自帶的Laboman EasyAcess6.0軟件進(jìn)行篩查，由于該儀器采血量大，篩查標(biāo)本排除5歲以下兒童及新生兒。選用MCHC作為篩選指標(biāo)有3個(gè)理由：①通過(guò)軟件篩查發(fā)現(xiàn)MCHC相對(duì)特異；②公式計(jì)算法：MCHC＝HB／HCT＝HB／RBC×MCV＝HB／RBC×（V1＋V2＋V3＋……Vn）／RBC＝HB／V1＋V2＋V3＋……Vn，n＝RBC 數(shù)，正常情況下血液分析儀是把細(xì)胞看作或者處理為球形檢測(cè)的，冷凝集時(shí)，正常RBC為雙凹盤狀，可抽象的看成“碟子”，冷凝集的程度與“碟子”疊在一起的程度有關(guān)；③叢玉隆等［8］認(rèn)為MCHC是一個(gè)相對(duì)恒定的值，其浮動(dòng)均值可以用于質(zhì)控的監(jiān)測(cè)。所以當(dāng)SYSMEX XN2000上MCHC＞400 g／L時(shí)要高度懷疑是冷凝集標(biāo)本，此時(shí)可重新采血后立即濕片鏡檢，觀察顯微鏡下RBC是否發(fā)生聚集。由此可見(jiàn)，MCHC不僅可以作為貧血指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，而且應(yīng)作為一個(gè)常規(guī)指標(biāo)對(duì)冷凝集進(jìn)行篩查。

溫度、滴度與冷凝集現(xiàn)象存在一定的關(guān)系。冷凝集素具有寬熱輻的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外［9－12］有 37 ℃、35.6 ℃及 4 ℃時(shí)發(fā)生冷凝集的報(bào)道，且本文中3例標(biāo)本溫度閾值較高。冷凝集素滴度在很低時(shí)亦可發(fā)生凝集，國(guó)外［12，13］有滴度在 1∶8，1∶64 時(shí)發(fā)生凝集的文獻(xiàn)報(bào)道。當(dāng)?shù)味却笥?∶2000時(shí)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝塊［14］，結(jié)合本文研究的結(jié)果，我們認(rèn)為凝集塊的大小與冷凝集素的滴度有關(guān)，凝集發(fā)生與否與溫度有關(guān)。

對(duì)冷凝集標(biāo)本處理的方案有很多種，并沒(méi)有固定的模式，應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況考慮。目前主要方法有重新采血立即檢測(cè)法、37℃熱水浴法、血漿置換法、血漿置換和水浴結(jié)合法，本文研究采用熱水浴加高型號(hào)SYSMEX XN系列分析儀，結(jié)合WDF、WNR散點(diǎn)圖也得到滿意的檢測(cè)結(jié)果。

綜上所述，雖然現(xiàn)在的血液分析儀已達(dá)到了相當(dāng)完善的程度，但儀器提供的信息只是一種提示，不能代表標(biāo)本的真實(shí)情況。在標(biāo)本量較大的醫(yī)院，尤其是門診可先用MCHC加濕片觀察法進(jìn)行篩查，然后嘗試熱水浴后用SYSMEX XN系列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合WDF、WNR散點(diǎn)圖和儀器提示信息進(jìn)行判斷，以提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率。但我們?cè)诠ぷ髦胁荒苊つ康囊蕾嚈C(jī)器，必要時(shí)仍需要手工鏡檢確認(rèn)、修正后才能發(fā)出完整的檢驗(yàn)報(bào)告，為臨床的診治提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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