乙基化衍生/頂空氣相色譜法快速測(cè)定葡萄酒中3種甲基錫

崔宗巖，周 樂(lè)，趙玉強(qiáng)，孫 揚(yáng)，葛 娜，李阿丹，曹彥忠*

(1．秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004;2．燕山大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島 066004)

有機(jī)錫是以Sn原子為中心，連接若干有機(jī)或無(wú)機(jī)基團(tuán)而組成的化合物。作為一類重要的有機(jī)金屬化合物，有機(jī)錫被廣泛應(yīng)用于船舶防污涂料、工業(yè)催化劑、農(nóng)業(yè)殺蟲和殺菌劑，以及聚氯乙烯(PVC)塑料的穩(wěn)定劑等［1］。有機(jī)錫化合物具有廣泛的毒性，其中三取代的有機(jī)錫化合物毒性最強(qiáng)，三丁基錫和三苯基錫是典型的內(nèi)分泌干擾物，三甲基錫有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性［2］。近年研究表明，一甲基錫和二甲基錫暴露與生物體學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的行為模式損傷具有一定關(guān)聯(lián)［3］。

有機(jī)錫化合物廣泛存在于水和沉積物等環(huán)境介質(zhì)［4］、工業(yè)品［5］和食品［6］中。葡萄酒在生產(chǎn)、加工及儲(chǔ)存過(guò)程中，其原材料和容器設(shè)備可能受到有機(jī)錫的污染，導(dǎo)致有機(jī)錫化合物殘留在葡萄酒中。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，葡萄酒的消費(fèi)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，人們對(duì)葡萄酒的品質(zhì)要求也逐漸提高。然而，葡萄酒中有機(jī)錫的污染狀況及其對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)尚缺乏系統(tǒng)研究。目前僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道了酒類飲料中有機(jī)錫化合物的分析方法，包括格氏試劑衍生/氣相色譜法［7－8］、乙基化衍生結(jié)合液液萃取/氣相色譜法［9］、固相微萃取結(jié)合氣相色譜法［10－12］、分散液液微萃取結(jié)合氣相色譜法［13］、固相微萃取結(jié)合氣相色譜－質(zhì)譜法［14］以及微波輔助萃取結(jié)合高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法［15］等。然而，現(xiàn)有方法大多樣品處理流程復(fù)雜，需要耗費(fèi)大量的人力物力和較長(zhǎng)的分析時(shí)間。針對(duì)甲基錫化合物分子量小、揮發(fā)性強(qiáng)的特點(diǎn)，本研究采用四乙基硼化鈉進(jìn)行原位乙基化衍生，建立了葡萄酒中3種甲基錫化合物快速檢測(cè)的頂空氣相色譜法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 6890N型氣相色譜儀，配置火焰光度檢測(cè)器。氣相色譜條件:DB－1701色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250℃，分流進(jìn)樣，分流比為5∶1;載氣為高純氮?dú)猓懔髂Ｊ?，流速?.6 mL/min。升溫程序?yàn)?初始溫度40℃，保持1 min，以30℃/min升至250℃，保持2 min?；鹧婀舛葯z測(cè)器溫度為250℃，氫氣與空氣流速均為75 mL/min。

HSS 86.50型靜態(tài)頂空自動(dòng)進(jìn)樣器(DANI公司)，頂空實(shí)驗(yàn)條件:平衡爐溫80℃，定量環(huán)溫度90℃，傳輸線溫度95℃，平衡時(shí)間45 min，振蕩幅度為快速振蕩，循環(huán)時(shí)間20 min，加壓時(shí)間0.1 min，定量環(huán)填充時(shí)間0.1 min，進(jìn)樣時(shí)間0.3 min。

1.2 試劑與材料

有機(jī)錫標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，包括一甲基三氯化錫(98%，MMT)，二甲基二氯化錫(99.9%，DMT)，三甲基氯化錫(96%，TMT)。有機(jī)錫標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液濃度均為1 g/L，以甲醇(色譜純，迪馬公司)配制，于－20℃冰箱中儲(chǔ)存。工作液濃度為1 mg/L，采用超純水進(jìn)行逐級(jí)稀釋獲得，于4℃冰箱中儲(chǔ)存，每周需重新配制。

衍生試劑四乙基硼化鈉(NaBEt4，98%)購(gòu)于美國(guó)CNW公司，其儲(chǔ)備液以200 g/L配制于四氫呋喃(色譜純，迪馬公司)溶液中，置于冰箱中－20℃儲(chǔ)存。工作液用超純水稀釋至終濃度為20 g/L，每工作日進(jìn)行配制。儲(chǔ)備液和工作液均儲(chǔ)存在深棕色、密封良好的玻璃瓶中。冰乙酸(HAc，優(yōu)級(jí)純)購(gòu)自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，無(wú)水乙酸鈉(NaAc，分析純)購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，以超純水配成濃度為0.2 mol/L的HAc－NaAc緩沖溶液(pH 4.8)。

實(shí)驗(yàn)所用頂空瓶為鉗口透明玻璃瓶，規(guī)格20 mL(23 mm×75 mm)，配硅橡膠/PTFE墊和瓶蓋，均購(gòu)自迪馬公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取2.0 g葡萄酒樣品置于頂空瓶中，加入8 mL pH 4.8的HAc－NaAc緩沖溶液，然后加入200 μL 2%NaBEt4，立即密閉瓶塞，置于頂空自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)行頂空萃取、進(jìn)樣、色譜分離和檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

由于3種甲基錫的乙基化衍生產(chǎn)物分子量小，易揮發(fā)，因而氣相色譜的保留時(shí)間較小，實(shí)驗(yàn)選取較低的初始溫度(40℃)，以保證3種化合物在柱頭實(shí)現(xiàn)良好的聚集，有利于后續(xù)程序升溫分離。采用空白葡萄酒基質(zhì)添加50.0 μg/kg的3種甲基錫化合物，在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)比了不分流，以及分流比為5∶1，10∶1和20∶1條件下目標(biāo)物的分離及響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不分流情況下，3種目標(biāo)物的峰形展寬，分離效果較差;而分流比10∶1和20∶1時(shí)，目標(biāo)物分離良好，但響應(yīng)較低;分流比為5∶1時(shí)，3種目標(biāo)物的分離效果良好，且響應(yīng)最高(見圖1)。因而，實(shí)驗(yàn)選定的分流比為5∶1。

2.2 頂空條件的優(yōu)化

考察了溫度對(duì)甲基錫化合物萃取的影響。結(jié)果表明，頂空溫度對(duì)3種甲基錫存在不同程度的影響。當(dāng)溫度由50℃升至80℃時(shí)，三甲基錫的響應(yīng)基本保持穩(wěn)定，二甲基錫的響應(yīng)緩慢增加，而一甲基錫的響應(yīng)隨之迅速增加(圖2A)。當(dāng)溫度繼續(xù)增至90℃時(shí)，3種甲基錫的響應(yīng)保持不變或略有降低。綜合上述結(jié)果，確定最佳頂空溫度為80℃。

考察了萃取時(shí)間在5～60 min范圍內(nèi)時(shí)3種甲基錫的響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，3種甲基錫化合物的響應(yīng)逐漸增大，在45 min時(shí)達(dá)到最高值，萃取時(shí)間繼續(xù)增至60 min時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)保持不變或略有降低。因而，確定頂空時(shí)間為45 min。

圖1 分流比5∶1條件下3種甲基錫化合物的分離和響應(yīng)Fig.1 Separation and responses of three methyltin compounds under split modes with split ratio of 5∶1 concentration was 50.0 μg/kg for each analyte

對(duì)比了不振蕩(No)、緩慢振蕩(Soft)和快速振蕩(Fast)對(duì)3種目標(biāo)物響應(yīng)的影響，結(jié)果表明，F(xiàn)ast方式下目標(biāo)物的響應(yīng)最高，因而實(shí)驗(yàn)選擇快速振蕩方式。

2.3 衍生條件的優(yōu)化

衍生試劑對(duì)甲基錫的衍生至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)中，首先要保證衍生試劑足量，使目標(biāo)物得以完全衍生;其次，由于NaBEt4母液配制于四氫呋喃溶劑中，過(guò)量的衍生試劑會(huì)使體系中有機(jī)溶劑含量增加，其進(jìn)入頂空環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的萃取效率降低。分別考察了衍生試劑(2%NaBEt4)加入量為20，50，100，200，500 μL時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)，結(jié)果顯示，隨著衍生試劑用量的增加，3種甲基錫化合物的響應(yīng)逐漸增大，當(dāng)衍生試劑加入量為200 μL時(shí)，3種甲基錫響應(yīng)均達(dá)到或接近最高值，繼續(xù)增加衍生試劑用量至500 μL，目標(biāo)物響應(yīng)無(wú)明顯增加。因而，實(shí)驗(yàn)確定衍生試劑加入量為200 μL。

圖2 溫度(A)及pH值(B)對(duì)甲基錫化合物萃取的影響Fig.2 Temperature(A)and pH value(B)on extraction efficiencies of methyltin compounds

有機(jī)錫的乙基化衍生反應(yīng)中，一般選用HAc－NaAc作為緩沖溶液，體系pH值為4.0～5.5之間［16］。本研究考察了pH值為3.0～5.5時(shí)3種有機(jī)錫的衍生效果。如圖2B所示，隨著pH值由3.0增加至4.8，目標(biāo)物的響應(yīng)逐漸增大，而當(dāng)pH值繼續(xù)增加至5.5，目標(biāo)物的響應(yīng)反而降低，因而選定4.8為最佳pH值。

通過(guò)向體系加入不同濃度的NaCl(0，1%，2%，5%，10%)考察了鹽度對(duì)于甲基錫衍生和萃取的影響。結(jié)果顯示，隨著鹽度增加3種甲基錫的響應(yīng)均無(wú)明顯變化。因此，實(shí)驗(yàn)采取不加鹽的方式進(jìn)行。

2.4 檢出限與線性范圍

采用基質(zhì)外標(biāo)工作曲線法進(jìn)行定量，葡萄酒基質(zhì)由若干空白樣品混合獲得。向其中添加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品中3種有機(jī)錫的含量分別為2.0，4.0，10.0，20.0，40.0，100.0，200.0 μg/kg。按照上述樣品處理流程進(jìn)行衍生和頂空氣相色譜檢測(cè)，獲得基質(zhì)匹配工作曲線。如表1所示，該方法在4.0～200.0 μg/kg范圍內(nèi)具有良好線性(r2≥0.994)。在葡萄酒基質(zhì)中，以3倍信噪比(S/N=3)所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度為其檢出限(LOD)，得到3種甲基錫化合物的LOD為1.0～1.2 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)為3.3～4.0 μg/kg。

2.5 回收率與精密度

選取干白、干紅和桃紅3種代表性的空白葡萄酒基質(zhì)，分別向其中添加5.0，10.0，100.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的3種甲基錫化合物進(jìn)行檢測(cè)。由表2結(jié)果可見，3種甲基錫的回收率為80.5%～101.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%～8.5%，說(shuō)明方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 3種甲基錫化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 1 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ)of three methyltin compounds

表2 3種甲基錫化合物的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations(RSD)of three methyltin compounds(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)75個(gè)市售各類型葡萄酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出一甲基錫和三甲基錫，18個(gè)樣品中檢出微量二甲基錫，檢出量為1.2～3.1 μg/kg。檢測(cè)結(jié)果表明市售葡萄酒中甲基錫的含量較低，但其對(duì)人體的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)仍需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)檢測(cè)葡萄酒中三甲基錫、二甲基錫和一甲基錫的乙基化衍生/頂空氣相色譜－火焰光度檢測(cè)法。方法具有操作簡(jiǎn)單、快速和不需要消耗劇毒有機(jī)溶劑的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，且自動(dòng)化程度高，單個(gè)樣品的平均分析時(shí)間不超過(guò)25 min，極大地簡(jiǎn)化了操作，節(jié)約了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。且具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于葡萄酒中此3種甲基錫化合物的快速篩查檢測(cè)。

［1］Sousa A C A，Pastorinho M R，Takahashi S，Tanabe S．Environ.Chem.Lett．，2014，12(1):117 －137．

［2］Geloso M C，Corvino V，Michetti F．Neurochem.Int．，2011，58(7):729 －738．

［3］Krueger K，Hoeing T，Bensch W，Diepgrond V，Ahnefeld M，Madeja M，Binding N，Musshoff U．Neurotoxicology，2007，28(1):114－125．

［4］Okoro H K，F(xiàn)atoki O S，Adekola F A，Ximba B J．Asian J.Chem．，2011，23(2):473 －482．

［5］Deng A H，Pang J S，Peng X J，Ji W J，Wen Q J．J.Instrum.Anal．(鄧愛華，龐晉山，彭曉俊，姬文晉，溫綺靖．分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2015，34(1):35－42．

［6］Zhao K X，Zhao Y F，Wu Y N．Chin.J.Prevent.Med．(趙孔祥，趙云峰，吳永寧．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志)，2007，41(6):453－457．

［7］GB/T 5009．215 －2008．Determination of Organotins in Foods．National Standards of the Peoples Republic of China(食品中有機(jī)錫含量的測(cè)定．中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))．2008．

［8］Zhao K X，Zhao Y F，Ling Y，Chu X G，Wu Y N．J.Hyg.Res．(趙孔祥，趙云峰，凌云，儲(chǔ)曉剛，吳永寧．衛(wèi)生研究)，2008，37(3):327－331．

［9］Zhang W，Wan Y Q．Food Sci．(張聞，萬(wàn)益群．食品科學(xué))，2012，33(14):117－120．

［10］Liu J Y，Jiang G B．J.Agric.Food Chem．，2002，50(23):6683－6687．

［11］Jiang G B，Liu J Y，Zhou Q F．Environ.Sci.Technol．，2004，38(16):4349－4352 ．

［12］Heroult J，Bueno M，Potin－Gautier M，Lespes G．J.Chromatogr.A，2008，1180(1/2):122－130．

［13］Smitiene V，Semasko I，Vickackaite V．J.Sep.Sci．，2014，37(15):1989 －1995．

［14］Azenha M，Vasconcelos M T．Anal.Chim.Acta，2002，458(1):231－239．

［15］Liu Y X，Wan Y Q，Guo L．Anal.Lett．，2014，47(2):343 －355．

［16］Mester Z，Sturgeon R，Pawliszyn J．J.Spectrochim.Acta B，2001，56(3):233 －260．