聯(lián)麥氧釩對糖尿病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制

李 穎，叢曉強，趙良臣，謝 林，劉 婭

（1.吉林省人民醫(yī)院急診內(nèi)科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長春 130021；3.吉林省吉林市中心醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 吉林 132011；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種在世界范圍流行的重要疾病，已成為嚴重影響我國國民健康的公共衛(wèi)生問題。最新數(shù)據(jù)［1］顯示：截至2012年中國DM患病人數(shù)已達9240萬以上，居世界第一，DM前期患者已高達1.48億，預(yù)計到2030年中國DM患者將增至約1.3億。目前DM已成為人類第4大死亡原因，占全球總死亡率的6.8%［2］。1974年糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）的概念被首次提出，其是獨立于高血壓、冠心病和心臟瓣膜病的心肌病，目前認為是導(dǎo)致DM患者死亡的主要原因［3］。釩是一種具有獨特化學(xué)性質(zhì)和生物活性的人體必需微量元素，聯(lián)麥氧釩 ［bis（maltolato）oxovandium，BMOV］是一種有機釩絡(luò)合物，研究［4－5］顯示：BMOV可促進糖原合成，增加肌肉、脂肪等胰島素敏感組織對葡萄糖的攝取和利用，并對胰島素抵抗和高胰島素血癥造成的靶器官如心肌、視網(wǎng)膜有一定的保護作用。在胰島β細胞中釩通過對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的調(diào)節(jié)抑制細胞凋亡，因而有理由假設(shè)釩可能參與調(diào)節(jié)心肌細胞中ERS介導(dǎo)的細胞凋亡，從而起到保護心肌細胞的作用。本實驗通過構(gòu)建大鼠DM模型，給予飲水中加入BMOV，探討B(tài)MOV對DM大鼠ERS介導(dǎo)的心肌細胞凋亡的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康雄性清潔級Wistar大鼠35只，體質(zhì)量200～220g，購于吉林大學(xué)實驗動物部；將大鼠置于吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)研究所飼養(yǎng)，每籠2只，室溫控制在17～21℃，控制晝夜光照。飼料購自吉林大學(xué)實驗動物中心；BMOV購自上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號H 129021；鏈脲佐霉素（STZ）購自美國Sigma公司；TUNEL試劑盒購自銳博生物有限公司；GADPH、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）抗體購自英國Abcam公司，CCCAAT／增強子結(jié)合慢白同源蛋白（CHOP）抗體發(fā)光試劑購自上海碧云天生物試劑公司；X盒結(jié)合蛋白1（XBP－1）抗體購自美國Sigma公司；qPCR引物為上海生工合成；qPCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。UV－265可見－紫外光分光光度計（日本島津公司）。

1.2 實驗分組、模型建立和給藥 對照組：隨機取10只大鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液（pH 4.5，濃度0.1mmol·L－1）＋正常飲水＋常規(guī)喂養(yǎng)，維持4周。其余25只大鼠一次性腹腔注射STZ建立DM動物模型［6］，濃度為40g·L－1，劑量為55mg·kg－1，1周后檢測大鼠空腹的尾靜脈血糖，血糖≥13.3mmol·L－1定為 DM 大鼠，STZ誘導(dǎo)過程中5只大鼠未達DM成模標準，予以剔除，取成模20只大鼠隨機分為DM組和BMOV組，每組10只。DM組大鼠正常飲水＋常規(guī)喂養(yǎng)，繼續(xù)維持3周；BMOV組大鼠飲水中加入BMOV（將BMOV溶解在飲水中，起始飲水中BMOV 濃度為 0.25g· L－1，每3d增加0.25g·L－1，第9天達最高濃度1g·L－1，保持不變）＋常規(guī)喂養(yǎng)，共維持3周［7］。

1.3 TUNEL染色觀察大鼠心肌組織細胞凋亡情況 大鼠在3%戊巴比妥30mg·kg－1腹腔注射麻醉后，取左心室心肌組織，取一部分10%甲醛固定2d后行預(yù)處理，按試劑盒說明書，將組織切片脫蠟，梯度酒精浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUNEL反應(yīng)液，蓋膜，37℃孵育60min，PBS緩沖液沖洗3次，DAB室溫顯色10min，PBS洗滌3次，每次5min，梯度酒精脫水、透明和封片，于光鏡下觀察，每只大鼠3張切片，每個切片隨機計數(shù)無重疊具有代表性的5個400倍視野，以平均每100個細胞核中含凋亡細胞數(shù)量作為心肌細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）［8－9］。

1.4 Western blotting法檢測心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平 取部分新鮮左心室心肌組織，液氮研磨組織至單細胞狀態(tài)，加入裂解液（每10mg組織加入200μL，含PMSF），冰上裂解30min；4℃、12000r·min－1，離心15min，取上清，考馬斯亮藍G250測定蛋白質(zhì)溶液的吸光度（A）值，調(diào)整樣品的蛋白濃度，使各個樣品的濃度在同一水平（4～8g·L－1）。實驗采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS－PAGE，濃度為5%濃縮膠和15%濃度分離膠；每孔上樣40～60μg總蛋白，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準為普通Marker，相對分子質(zhì)量范圍為16000～220000。實驗選用Bio－Rad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置及PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，TBST溶液中漂洗1～2min，5%脫脂奶粉封閉液，室溫，50r·min－1，封閉60min。孵育一抗：根據(jù)蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗說明書，按1∶1000（GRP78）、1∶1500（CHOP）和1∶1000（XBP－1）比例稀釋一抗；將PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4℃孵育一抗過夜。孵育二抗：參考二抗說明書加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5000比例稀釋），室溫搖動孵育1h。使用BeyoECLPlus化學(xué)發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液和定影液洗片。

1.5 qPCR法檢測XBP－1mRNA表達水平 取部分新鮮冰凍左心室心肌組織，采用Trizol法提取總RNA，參考TaKaRa PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。XBP－1引物序列為上游：5′－AGTTAAGGACACGCTTGGGG－3′，下游：5′－ACGTAGTCTGAGTGCTGCG－3′。內(nèi)參 GAPDH 的引物序列為上游：5′－CACTCAGAAGACTGTGG－3′，下游：5′－TTCAGCTCTGGGATGACCTT－3′。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)參數(shù)參考TaKaRa SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑盒說明進行，Real－Time PCR的擴增曲線和融解曲線應(yīng)用 Bio－Rad CFX96Real－Time PCR System的操作方法進行，以目的基因XBP－1與內(nèi)參照基因GADPH值的比值表示目的基因相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0及Excel 2010軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖水平、 AI和GRP78、 CHOP、 XBP－1、XBP－1mRNA表達水平均以表示，組間兩兩比較采用Student－Newman－Keuls檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠基本情況 對照組：整個實驗過程中對照組大鼠生長及精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量明顯增加，空腹血糖正常，皮毛色澤正常，反應(yīng)敏捷。DM組：大鼠腹腔注射STZ成模后逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食和消瘦（三多一少）等癥狀，與對照組比較，第2～4周大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05），血糖明顯升高（P＜0.05），精神萎靡，皮毛臟亂無光澤。BMOV組：大鼠腹腔注射STZ成模后，第2周飲水中加入BMOV，大鼠多飲、多尿、多食和消瘦癥狀較DM組明顯好轉(zhuǎn)，第2～4周大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），血糖明顯下降（P＜0.05），精神尚可，皮毛干枯。見表1和2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups （n＝10，，m／g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups （n＝10，，m／g）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

1 2 3 4 Control 216.60±8.20 295.40±13.00 331.36±18 Group Body weight（week）.14 365.17±15.63 DM 213.54±7.20 178.09±13.98＊ 175.30±14.42＊ 185.94±15.99＊BMOV 214.87±7.36 236.18±16.87＊△ 248.04±20.99＊△ 262.66±20.13＊△

表2 各組大鼠空腹血糖水平Tab.2 Levels of fasting glucose of rats in various groups ［n＝10，，cB／（mmol·L－1）］

表2 各組大鼠空腹血糖水平Tab.2 Levels of fasting glucose of rats in various groups ［n＝10，，cB／（mmol·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

1 2 3 4 Control 5.18±0.36 5.35±0.36 5.47±0.29 5.21±Group Fasting glucose（week）0.35 DM 23.66±3.16 26.71±3.05＊ 27.94±1.91＊ 29.22±2.89＊BMOV 24.02±3.21 18.60±2.08＊△ 16.51±0.67＊△ 16.26±1.09＊△

2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況 TUNEL法檢測結(jié)果顯示：對照組大鼠心肌組織中見極少的凋亡細胞（細胞核呈棕黃色為凋亡細胞，呈淡藍色為正常細胞），AI為（0.80±0.63）%；DM組AI為（9.10±1.79）%；BMOV組AI 為（5.20±1.75）%。與對照組比較，DM組和BMOV組大鼠心肌細胞AI明顯升高（P＜0.05）；與DM組比較，BMOV組大鼠心肌細胞AI明顯下降（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌組織中 GRP78、CHOP和XBP－1表達水平 與對照組比較，DM組和BMOV組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平明顯升高（P＜0.05）；與DM組比較，BMOV組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平Tab.3 Expression levels of GRP78，CHOP，and XBP－1in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

表3 各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP和XBP－1表達水平Tab.3 Expression levels of GRP78，CHOP，and XBP－1in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with DM group.

GRP78 CHOP XBP－1 Group 2 Control 0.106±0.0110.274±0.0220.361±0.02 DM 0.207±0.014＊0.530±0.065＊0.499±0.055＊BMOV 0.153±0.010＊△0.364±0.031＊△0.419±0.032＊△

2.4 各組大鼠心肌組織中XBP－1mRNA表達水平與對照組（1.00±0.21）比較，DM組（3.10±0.29）和BMOV組（2.60±0.24）大鼠心肌組織中XBP－1mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與DM組比較，BMOV組XBP－1mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

DCM 是一個長期而 復(fù)雜的病理過程［10－11］，其由能量代謝異常導(dǎo)致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和肌原纖維等損傷，最終導(dǎo)致心肌細胞肥大和凋亡增加，進一步加重DCM過程中心肌重構(gòu)與功能障礙。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于所有真核細胞中，是真核細胞蛋白質(zhì)、膽固醇、脂類合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號肽識別及鈣穩(wěn)態(tài)維持的亞細胞器，參與新合成的分泌性蛋白和跨膜蛋白的糖基化修飾、折疊、寡聚化等過程，對細胞內(nèi)環(huán)境變化極度敏感。當細胞在高糖誘導(dǎo)下，能量代謝紊亂，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白過度蓄積，極易觸發(fā)ERS［12］。XBP－1是ERS中非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）元件重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，當細胞發(fā)生ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)重要跨膜蛋白分子IRE1與GRP78分離，發(fā)生寡聚糖化、自身磷酸化而激活，誘 導(dǎo) XBP－1mRNA特異性剪接，產(chǎn)生XBP－1smRNA，編碼XBP－1s蛋白，進入細胞核中與ERS反應(yīng)順式作用元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ERS相關(guān)基因的表達，啟動相關(guān)的細胞凋亡信號［13－14］。

近年研究［15－16］顯示：釩化合物具有明確的類胰島素樣活性，是一種很有前途的降糖藥物，其對DM大鼠的心肌損害和心功能具有明顯的保護作用，其可能的作用機制一直是研究的熱點和爭論的焦點。本研究中BMOV組大鼠血糖水平較DM組明顯降低，表明BMOV有降血糖作用；經(jīng)TUNEL染色后DM組大鼠心肌細胞凋亡較對照組明顯增加，GRP78、CHOP和XBP－1蛋白表達水平升高，XBP－1mRNA表達上調(diào)，表明在DM大鼠中ERS及其介導(dǎo)的細胞凋亡參與DCM的發(fā)生發(fā)展過程，并能夠加重心肌細胞損傷；BMOV組大鼠心肌細胞AI較DM組明顯降低，GRP78、CHOP和XBP－1表達明顯降低，XBP－1mRNA表達下調(diào)，表明BMOV對DM大鼠心肌細胞具有保護作用，其作用機制可能與抑制心肌細胞ERS及其介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)聯(lián)［17－18］，但是否是通過降低血糖實現(xiàn)的，尚需進一步研究。

本研究結(jié)果提示：臨床針對DCM的治療，除了有效控制血糖外，更應(yīng)進一步探尋潛在的、多層次的、多通路的聯(lián)合治療策略，減輕DM患者心肌病變的損傷。對于早期DM患者，可以考慮適當增加富含釩類食物如海鮮等的攝入，以改善患者的預(yù)后，提高其長期生存率。

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