• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    常壓室溫等離子體誘變選育微生物絮凝劑高產(chǎn)菌株

    2015-11-29 08:32:04郝建安楊波姜天翔張愛君張曉青司曉光杜瑾張雨山王靜
    生物技術(shù)通訊 2015年6期
    關(guān)鍵詞:致死率常壓絮凝劑

    郝建安,楊波,姜天翔,張愛君,張曉青,司曉光,杜瑾,張雨山,王靜

    國家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所,天津 300192

    微生物絮凝劑(microbail flocculant)是一類由微生物產(chǎn)生的,可使液體中固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞及膠體凝集、沉淀的特殊高分子代謝物。其具有安全無毒、無二次污染,作用對象廣泛、凈化效果明顯,來源廣泛、預(yù)期成本低等優(yōu)點(diǎn),已成為絮凝劑領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)[1]。

    微生物絮凝現(xiàn)象的研究起步很早,1876年,Louis Pasteur 就發(fā)現(xiàn)酵母菌可產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象[2]。1976年,Junji Nakamura 等分離到可產(chǎn)絮凝活性物質(zhì)的醬油曲 霉(Aspergillus sojae)AJ 7002[3];1986 年,Ryuichiro Kurane 等采用從自然界分離出的紅平紅球菌制成絮凝劑NOC-1,并把它用于畜產(chǎn)廢水處理、膨脹污泥處理、磚場生產(chǎn)廢水處理及廢水的脫色處理,都取得了很好的處理效果,被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的最好的生物絮凝劑[4];1991 年,Kazuki Toeda 等發(fā)現(xiàn)一株可產(chǎn)微生物絮凝劑的協(xié)腹產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes cupidus)KT201[5];2002年,Zhang Jianfa等自纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)NUST06 中分離到一種胞外多糖類絮凝劑[6];2010年,Satish V.Patil等自印度固氮菌(Azotobacter indicus)ATCC 9540 中也發(fā)現(xiàn)了胞外多糖類絮凝劑[7]。截止目前,科學(xué)家已經(jīng)陸續(xù)從陸地、海洋與其他環(huán)境中分離出多種絮凝活性微生物,涵蓋數(shù)十個種屬[8-11]。

    常壓室溫等離子體(atmospheric room-temperature plasma,ARTP),利用氦氣輝光放電產(chǎn)生的等離子體射流作用于微生物,引起微生物的突變。氦氣輝光放電的主要優(yōu)點(diǎn)包括:溫度低,射流的溫度可以維持在40℃以下;放電均勻;等離子體射流的活性粒子種類豐富,主要包括He*(氦的激發(fā)態(tài)),以及氮離子、氧離子等。等離子體射流的活性粒子可以作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA 物質(zhì)上,引起DNA 物質(zhì)的損傷,并通過不完全的修復(fù)過程引起基因位點(diǎn)突變。該方法首次應(yīng)用在鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的選育中,獲得高產(chǎn)除蟲菌素的突變株[12],目前用于綠色糖單胞菌(Saccharomonospora viridis)[13]、茂源鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)[14]、圓紅冬 孢酵母(Rhodosporidum toruloides)[15]等30 多種生物的誘變選育中。

    目前,微生物絮凝劑在工業(yè)化中的應(yīng)用受到生產(chǎn)成本過高的制約[16],因此,選育微生物絮凝劑的高產(chǎn)菌株,開展適合工業(yè)生產(chǎn)的菌株誘變育種,提高微生物絮凝劑的產(chǎn)量是非常必要的。在本研究中,我們利用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)對產(chǎn)絮凝劑的海洋地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)DHS-40 進(jìn)行誘變,篩選微生物絮凝劑高產(chǎn)菌株,并對突變株產(chǎn)微生物絮凝劑的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究,獲得了遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)突變菌株。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    產(chǎn)微生物絮凝劑菌株海洋地衣芽孢桿菌DHS-40 為本實(shí)驗(yàn)室從天津塘沽海河入海口的污泥中篩選并保存。

    LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH7.0(固體培養(yǎng)基添加1.5%~2%瓊脂粉),121℃滅菌30 min。

    1.2 菌懸液的制備

    取斜面保存的菌種,接種于LB 固體培養(yǎng)基中,30℃恒溫培養(yǎng)2 d,挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)2 d,取10 mL對數(shù)生長期菌液,4℃、6000 r/min 離心5 min,收集菌體,用10 mL 生理鹽水沖洗2~3 次,將菌體懸浮于無菌生理鹽水中制備菌懸液,并將菌懸液濃度調(diào)整到D600nm為0.5~0.7(106~108個/mL)。

    1.3 ARTP誘變方法

    采用北京思清源生物科技有限公司生產(chǎn)的ARTP-Ⅱ型常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)。吸取10 μL 制備好的菌懸液,涂布在已滅菌的金屬載片上,將載片置于載物臺上,調(diào)整載物臺高度,設(shè)定好處理時間后進(jìn)行照射。本實(shí)驗(yàn)以氦氣為載體,照射功率100 W,工作氣流量10 SLPM,照射距離2 mm。照射處理后將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL 無菌生理鹽水的EP管中,振蕩1~2 min,使附著在載片上的菌體洗脫到生理鹽水中,形成新的菌懸液。將新的菌懸液稀釋至10-4、10-5、10-6共3個梯度,每個梯度涂布3塊平板,將涂布后的平板放置培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

    分別考察照射時間為30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s時的活菌數(shù),以未處理樣品為參照,通過菌落計(jì)數(shù)計(jì)算致死率,確定最佳照射時間。

    1.4 絮凝活性篩選

    取6個大燒杯,每個燒杯中加入1 L調(diào)好濁度的水,其中1 個為空白對照,另5 個燒杯添加絮凝劑樣品。絮凝攪拌分兩階段控制:第一階段為快速混合階段,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,持續(xù)2 min;第二階段為反應(yīng)階段,攪拌轉(zhuǎn)速30 r/min,持續(xù)25 min。絮凝過程結(jié)束后,停止攪拌,收起攪拌槳,靜置沉淀15 min,沉淀結(jié)束后于距離上清液頂部2 cm 處取部分上清液,測量剩余濁度。

    1.5 篩選方法

    1.5.1 突變株初篩 選取經(jīng)絮凝試驗(yàn)后,處理水樣剩余濁度<25 NTU的誘變菌。

    1.5.2 突變株復(fù)篩 選取經(jīng)絮凝試驗(yàn)后,處理水樣剩余濁度<20 NTU的誘變菌。

    1.5.3 突變株終篩 將突變株與原始菌株進(jìn)行同步培養(yǎng),觀察同期絮凝活性變化,選取絮凝活性高于原始菌株的突變株。

    1.6 遺傳穩(wěn)定性分析

    為了檢驗(yàn)突變株的遺傳穩(wěn)定性,對篩選到的高產(chǎn)突變株進(jìn)行傳代培養(yǎng),測定不同傳代次數(shù)下突變株發(fā)酵液的表面張力。

    2 結(jié)果

    2.1 ARTP誘變致死率曲線

    在常壓室溫等離子體誘變育種中,影響菌株誘變效率的主要因素有照射距離、氣流量、放電功率和照射時間。為保證等離子體溫度低于40℃,設(shè)定照射功率100 W、工作氣流量10 SLPM、照射距離2 mm,在此條件下,等離子體誘變強(qiáng)度取決于照射時間的長短[12,17]。當(dāng)照射時間從30 s上升到300 s時,菌株致死率如圖1 所示??梢钥闯?,等離子體與海洋地衣芽孢桿菌DHS-40致死率之間有明顯的劑量累積效應(yīng),隨著照射時間的增加,菌體的致死率不斷升高。照射時間>60 s,DHS-40 致死率>60%;照射時間>240 s,致死率近100%。因此,選擇60~240 s為菌株DHS-40的最佳誘變照射時間。

    等離子體誘變?yōu)榉嵌ㄏ?,具隨機(jī)性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18],選擇菌株致死率在90%以上時,菌株突變率較高,且平板上菌落分散性較好,便于單菌落挑選。因此,選取致死率在90%以上平板的單菌株進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選。

    2.2 絮凝劑高產(chǎn)菌株的篩選

    共分離得到396 株誘變株,經(jīng)過初篩、復(fù)篩,共計(jì)篩選得到8 株絮凝活性較高的誘變菌。將DHS-40突變菌株與原始菌株同步培養(yǎng),其生長狀態(tài)與絮凝活性同步曲線見圖2、3。

    由圖2 可見,所有突變株的生長都比原始菌株要好,生長速率較快,尤其是90-102 與120-24 菌株的生長最為迅速,同期生長速率達(dá)到原始菌株的1.5倍以上。

    由圖3 可見,除90-102 與120-24 株外,其他突變株同期絮凝活性低于原始菌株,這2 株突變菌株的同期絮凝活性達(dá)到原始菌株的1.5倍以上。

    2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

    誘變菌株遺傳穩(wěn)定性對發(fā)酵生產(chǎn)非常重要,由于突變菌株在傳代過程中可能會出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象,導(dǎo)致高產(chǎn)菌株傳代后出現(xiàn)生產(chǎn)性衰退[19],因此必須對菌株傳代過程中遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究。為驗(yàn)證突變株遺傳穩(wěn)定性,對突變株進(jìn)行6 代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng),并檢測每一代發(fā)酵液絮凝活性,結(jié)果如圖4 所示??梢钥闯?,突變株有較好的遺傳穩(wěn)定性,連續(xù)傳代6 次,突變株處理后水樣的剩余濁度一直在30 NTU左右。

    3 討論

    圖1 海洋地衣芽孢桿菌DHS-40在不同照射時間下的致死率曲線

    圖2 原始菌和突變株同步生長曲線

    微生物絮凝劑是具有絮凝活性的生物大分子物質(zhì),與化學(xué)絮凝劑相比,具有無毒、能生物降解等優(yōu)點(diǎn),未來在環(huán)保、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。目前微生物絮凝劑的主要問題是產(chǎn)量太低,導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高,限制了其應(yīng)用推廣。選育高產(chǎn)微生物絮凝劑菌株,是提高微生物絮凝劑產(chǎn)量的方法之一,在發(fā)酵工業(yè)中,大部分都采用誘變菌株作為生產(chǎn)菌株。

    本研究采用一種新的誘變育種方法,該方法產(chǎn)生的等離子體射流活性粒子種類豐富、放電均勻,與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比,具有操作簡單、安全性高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于微生物誘變育種中。楊穎[13]等對綠色糖單胞菌進(jìn)行快速誘變,篩選出木聚糖酶高產(chǎn)菌株酶活比原始菌株提高17 倍;夏書琴[14]等利用ARTP 誘變茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense),谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活達(dá)2.73 U/mL,比原始菌株提高82%。等離子體作用于微生物,導(dǎo)致其DNA 物質(zhì)的損傷,但部分微生物會通過自身的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)存活,使微生物基因序列和代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化,導(dǎo)致微生物的突變[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中,菌株經(jīng)過等離子體誘變后,最終篩選出2 株高產(chǎn)的突變株90-102 與120-24。這2 株突變株生長速率提高了近1.5倍,同期絮凝活性也提高了近1.5倍。因此,ARTP育種能有效提高菌株微生物絮凝劑產(chǎn)量,篩選出微生物絮凝劑的高產(chǎn)誘變株。

    圖3 原始菌和突變株同步絮凝曲線

    圖4 突變株遺傳穩(wěn)定性

    綜上,我們利用常壓室溫等離子體誘變海洋地衣芽孢桿菌DHS-40,通過搖瓶篩選微生物絮凝劑的高產(chǎn)菌株,獲得2 株高產(chǎn)的突變株90-102 與120-24,與原始菌株相比,生長速率提高了近1.5倍,同期絮凝活性也提高了近1.5倍,且傳代試驗(yàn)證實(shí)該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

    [1]周云,劉英,張志強(qiáng),等.微生物絮凝劑制備的研究新進(jìn)展[J].環(huán)境污染與防治,2014,36(4):80-85.

    [2]Pasteurl.Etudes sur la Biere[M].Paris:Gauthier villars,1876.

    [3]Nakamura J,Miyashiro S,Hirose Y.Purification and chemical-analysis of microbial cell flocculant produced by Aspergillus sojae AJ7002[J].Agric Biol Chem,1976,40(3):619-624.

    [4]Ryuichiro K,Kiyoshi T,Tomoo S.Screening for and characteristics of microbial flocculants[J].Agric Biol Chem,1986,50(9):2301-2307.

    [5]Toeda K,Kurane R.Microbial flocculant from Alcaligenes cupidus KT201[J].Agric Biol Chem,1991,55(11):2793-2799.

    [6]Zhang J F,Wang R Y,Jiang P J,et al.Production of an exopolysaccharide bioflocculant by Sorangium cellulosum[J].Lett Appl Microbiol,2002,34(3):178-181.

    [7]Patil S V,Salunkhe R B,Patil C D,et al.Bioflocculant exopolysaccharide production by Azotobacter indicus using flower extract of Madhuca latifolia L[J].Appl Biochem Biotechnol,2010,162(4):1095-1108.

    [8]李嬋娟,嚴(yán)鶴松.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及其絮凝特性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,14:3283-3286.

    [9]韓宴秀,莫創(chuàng)榮,周云新,等.絮凝劑產(chǎn)生菌克雷伯氏桿菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2014,18:177-182.

    [10]Ahmad H R A,Azni I,Hamid H R A,et al.Flocculation behavior and mechanism of bioflocculant produced by Aspergil-lus flavus[J].J Environ Manage,2015,150:466-471.

    [11]Sanjukta S,Neha B,Mihirjyoti P,et al.Bioflocculant production and biosorption of zinc and lead by a novel bacterial species,Achromobacter sp.TERI-IASST N,isolated from oil refinery waste[J].Chemosphere,2014,113:116-124.

    [12]Wang L Y,Huang Z L,Li G,et al.Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma[J].J Appl Microbiol,2010,108(3):851-858.

    [13]楊穎,玉王寧,金一,等.常壓室溫等離子快速誘變綠色糖單孢菌篩選木聚糖酶高產(chǎn)菌株及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(5):905-915.

    [14]夏書琴,劉龍,張東旭,等.大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變選育谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報(bào),2010,37(11):1642-1649.

    [15]金麗華,方明月,張翀,等.常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性[J].生物工程學(xué)報(bào),2011,27(3):461-467.

    [16]劉立凡,聶錦旭.中國微生物絮凝劑的生產(chǎn)研究現(xiàn)狀[J].環(huán)境污染與防治,2007,29(4):276-279.

    [17]Li G,Li H P,Wang Y L,et al.Genetic effects of radio-frequency,atmospheric-pressure glow discharges with helium[J].Appl Physics Lett,2008,92(22):221504.

    [18]Hua X F,Wang J,Wu Z J,et al.A salt tolerant Enterobacter cloacae mutant for bioaugmentation of petroleum-and salt-contaminated soil[J].Biochem Eng J,2010,49(2):201-206.

    [19]周德慶.微生物學(xué)教程[M].2 版.北京:高等教育出版社,2002:213-216.

    [20]Pompl R,Jamitzky F,Shimizu T,et al.The effect of low-temperature plasma on bacteria as observed by repeated AFM imaging [J].New J Physics,2009,11(11):115023.

    [21]Morfill G E,Kong M G,Zimmermann J L.Focus on plasma medicine[J].New J Physics,2009,11(11):115011.

    猜你喜歡
    致死率常壓絮凝劑
    低毒高效空倉煙霧殺蟲技術(shù)應(yīng)用探究
    常壓儲罐底板泄漏檢測技術(shù)
    臺灣致死率升至5.2%
    一種基于常壓消解儀同時測定煙用有機(jī)肥中總氮、總磷、總鉀含量的樣品前處理方法
    云南化工(2020年11期)2021-01-14 00:50:44
    低溫常壓等離子技術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用
    一種油井水泥用抗分散絮凝劑
    月圓之夜車禍致死率高
    絮凝劑在造紙行業(yè)中的應(yīng)用及進(jìn)展
    常壓制備SiO2氣凝膠的研究進(jìn)展
    聚硅酸/聚丙烯酰胺復(fù)合絮凝劑的研究
    中國塑料(2016年10期)2016-06-27 06:35:36
    国产亚洲精品第一综合不卡 | 99热这里只有是精品在线观看| av黄色大香蕉| 精品酒店卫生间| 国产黄频视频在线观看| 人人澡人人妻人| 狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜免费男女啪啪视频观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品久久久久久久久免| 捣出白浆h1v1| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 99re6热这里在线精品视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 精品酒店卫生间| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成人影院久久| 欧美精品亚洲一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 全区人妻精品视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 美国免费a级毛片| 国产深夜福利视频在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 黄色毛片三级朝国网站| 久久综合国产亚洲精品| 一级黄片播放器| 人妻 亚洲 视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 天美传媒精品一区二区| 中文字幕免费在线视频6| 不卡视频在线观看欧美| 成人国产麻豆网| 亚洲色图综合在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品少妇内射三级| 在线观看人妻少妇| 男女下面插进去视频免费观看 | a级片在线免费高清观看视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩av免费高清视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| av在线老鸭窝| 午夜福利网站1000一区二区三区| 97在线视频观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| h视频一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 免费人成在线观看视频色| 日本黄大片高清| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一本久久精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲av中文av极速乱| 国产视频首页在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩伦理黄色片| 国产av国产精品国产| 久久久久久久国产电影| videosex国产| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 新久久久久国产一级毛片| 色网站视频免费| 色吧在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 午夜免费观看性视频| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲情色 制服丝袜| 成人二区视频| 欧美日韩综合久久久久久| 国产成人免费观看mmmm| av不卡在线播放| 97在线人人人人妻| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产免费一级a男人的天堂| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲久久久国产精品| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 蜜桃国产av成人99| 国产精品久久久av美女十八| 人体艺术视频欧美日本| 少妇被粗大猛烈的视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 在线 av 中文字幕| 久久精品国产a三级三级三级| 国产一区二区三区综合在线观看 | 免费av中文字幕在线| 成年人午夜在线观看视频| av线在线观看网站| 看免费成人av毛片| av在线观看视频网站免费| 青春草亚洲视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 五月开心婷婷网| 成人毛片a级毛片在线播放| 中国三级夫妇交换| 99九九在线精品视频| 18禁观看日本| 亚洲在久久综合| 男的添女的下面高潮视频| 少妇人妻久久综合中文| av国产久精品久网站免费入址| 三上悠亚av全集在线观看| 伦精品一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 女人精品久久久久毛片| 国产片内射在线| 最近手机中文字幕大全| 丰满饥渴人妻一区二区三| 一个人免费看片子| 国产在线免费精品| 1024视频免费在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 少妇熟女欧美另类| 国产成人精品一,二区| 国产成人精品福利久久| 2022亚洲国产成人精品| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国内精品宾馆在线| 亚洲,欧美精品.| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一边亲一边摸免费视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲三级黄色毛片| 免费观看av网站的网址| 亚洲情色 制服丝袜| 成年av动漫网址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产激情久久老熟女| a级毛色黄片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日日撸夜夜添| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费高清在线观看日韩| 久久ye,这里只有精品| 国产成人欧美| 免费观看在线日韩| 黄色怎么调成土黄色| 男人舔女人的私密视频| 男的添女的下面高潮视频| 欧美性感艳星| 国产成人精品一,二区| 最新的欧美精品一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品一区蜜桃| 边亲边吃奶的免费视频| 日日爽夜夜爽网站| 日日啪夜夜爽| 91aial.com中文字幕在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 三上悠亚av全集在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 成人漫画全彩无遮挡| 九九爱精品视频在线观看| 免费观看在线日韩| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产69精品久久久久777片| 老司机影院毛片| 一边亲一边摸免费视频| 国产在线一区二区三区精| 满18在线观看网站| 黄色毛片三级朝国网站| 蜜桃在线观看..| 欧美bdsm另类| 水蜜桃什么品种好| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美精品一区二区免费开放| 女性被躁到高潮视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 成人影院久久| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲精品国产av蜜桃| 寂寞人妻少妇视频99o| 丰满迷人的少妇在线观看| 乱人伦中国视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 丝袜美足系列| 久热这里只有精品99| 99香蕉大伊视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品三级大全| 免费黄频网站在线观看国产| 五月伊人婷婷丁香| 一级黄片播放器| 久久久久久久久久人人人人人人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| h视频一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 夫妻性生交免费视频一级片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 男女午夜视频在线观看 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩中字成人| 欧美日韩av久久| 岛国毛片在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 好男人视频免费观看在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲综合色网址| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久 成人 亚洲| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 日本黄大片高清| 亚洲色图综合在线观看| 人妻一区二区av| 亚洲综合色网址| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲在久久综合| 少妇的逼好多水| av线在线观看网站| av福利片在线| 国产日韩欧美视频二区| 久久人妻熟女aⅴ| av在线播放精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品午夜福利在线看| 中文字幕制服av| 一级,二级,三级黄色视频| 人妻人人澡人人爽人人| 精品酒店卫生间| av天堂久久9| 国产精品久久久av美女十八| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美3d第一页| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久久国产网址| 制服人妻中文乱码| 人妻 亚洲 视频| av免费在线看不卡| 香蕉精品网在线| 一级,二级,三级黄色视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲性久久影院| 日韩av免费高清视频| 99久久人妻综合| 久久99精品国语久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲一码二码三码区别大吗| 我要看黄色一级片免费的| 十八禁网站网址无遮挡| 久久热在线av| 蜜桃在线观看..| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 又大又黄又爽视频免费| 丝袜在线中文字幕| 日产精品乱码卡一卡2卡三| www日本在线高清视频| 国产精品.久久久| 久久综合国产亚洲精品| a级片在线免费高清观看视频| 欧美精品国产亚洲| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩伦理黄色片| 99热这里只有是精品在线观看| 永久免费av网站大全| 咕卡用的链子| 国产在线视频一区二区| 天堂8中文在线网| 日韩一区二区视频免费看| 日日撸夜夜添| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲国产精品专区欧美| 久久精品国产a三级三级三级| 一区在线观看完整版| 久久久久国产精品人妻一区二区| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品日本国产第一区| 色94色欧美一区二区| 天美传媒精品一区二区| 91精品三级在线观看| 多毛熟女@视频| 国产又爽黄色视频| 精品一区二区免费观看| 中文字幕亚洲精品专区| 免费在线观看黄色视频的| 激情视频va一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 51国产日韩欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品一区蜜桃| 国产一区二区在线观看av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美日韩精品成人综合77777| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 色网站视频免费| 91精品国产国语对白视频| 亚洲久久久国产精品| 搡老乐熟女国产| 久久婷婷青草| 97在线视频观看| 久久狼人影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲天堂av无毛| 人妻系列 视频| a级毛片在线看网站| 国产片特级美女逼逼视频| 免费观看在线日韩| 老司机亚洲免费影院| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲综合精品二区| 国产熟女欧美一区二区| 高清欧美精品videossex| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久青草综合色| 久久久久久久久久成人| 天堂8中文在线网| 色5月婷婷丁香| 一级毛片电影观看| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产片内射在线| 少妇被粗大的猛进出69影院 | tube8黄色片| 亚洲av男天堂| 天天影视国产精品| 午夜激情久久久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 丁香六月天网| 成人国产av品久久久| 午夜91福利影院| 亚洲成色77777| 91精品国产国语对白视频| 九草在线视频观看| 亚洲色图综合在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久99热这里只频精品6学生| 久久av网站| 久久久久人妻精品一区果冻| 尾随美女入室| 一区二区三区四区激情视频| 少妇高潮的动态图| 精品国产国语对白av| 夫妻性生交免费视频一级片| 一本大道久久a久久精品| 99国产综合亚洲精品| 美国免费a级毛片| 精品国产露脸久久av麻豆| 午夜91福利影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲人成77777在线视频| 午夜91福利影院| 插逼视频在线观看| 老司机影院成人| 男女免费视频国产| 午夜激情av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 免费日韩欧美在线观看| 中文天堂在线官网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久精品区二区三区| 日韩中字成人| 日日啪夜夜爽| 午夜激情久久久久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜免费鲁丝| 亚洲av电影在线进入| 咕卡用的链子| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 91aial.com中文字幕在线观看| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产av影院在线观看| 老熟女久久久| 在线观看三级黄色| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av在线播放精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 一本久久精品| 美女大奶头黄色视频| 久久精品夜色国产| av播播在线观看一区| 婷婷成人精品国产| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品乱久久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久久精品精品| 亚洲成色77777| 亚洲精品国产av成人精品| 国产成人精品无人区| a 毛片基地| 2022亚洲国产成人精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本wwww免费看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女国产视频网站| 热99久久久久精品小说推荐| 91在线精品国自产拍蜜月| 五月开心婷婷网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产黄色视频一区二区在线观看| 午夜av观看不卡| 亚洲美女搞黄在线观看| av免费在线看不卡| 人妻 亚洲 视频| 国产综合精华液| 九草在线视频观看| 欧美人与性动交α欧美软件 | 黄色 视频免费看| 精品国产一区二区久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 国产探花极品一区二区| 99九九在线精品视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 黄片无遮挡物在线观看| av线在线观看网站| 亚洲内射少妇av| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产av国产精品国产| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲国产精品成人久久小说| 熟女电影av网| 美女国产高潮福利片在线看| av播播在线观看一区| 内地一区二区视频在线| 久久久国产一区二区| 宅男免费午夜| 精品少妇内射三级| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲成人一二三区av| 精品国产一区二区久久| 青春草视频在线免费观看| 久久热在线av| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲国产色片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 观看av在线不卡| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产最新在线播放| 1024视频免费在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产男人的电影天堂91| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久久久国产电影| 久久久国产一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美成人午夜精品| 日本与韩国留学比较| 丰满饥渴人妻一区二区三| 视频区图区小说| 精品视频人人做人人爽| 久久97久久精品| 男女免费视频国产| 亚洲精品456在线播放app| av片东京热男人的天堂| av视频免费观看在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩三级伦理在线观看| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产最新在线播放| 国产极品天堂在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 免费av不卡在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 99久久人妻综合| 丰满乱子伦码专区| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品日本国产第一区| 日本色播在线视频| 成人综合一区亚洲| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产免费福利视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产精品专区欧美| 18禁国产床啪视频网站| av电影中文网址| 日本与韩国留学比较| 久久久国产欧美日韩av| 天堂8中文在线网| 久久人妻熟女aⅴ| 成人二区视频| 一级片'在线观看视频| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 超色免费av| 涩涩av久久男人的天堂| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人体艺术视频欧美日本| 欧美3d第一页| 午夜激情久久久久久久| 国产精品.久久久| 久久精品夜色国产| av片东京热男人的天堂| 伦精品一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲成人一二三区av| 亚洲国产欧美在线一区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲国产精品成人久久小说| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久99精品国语久久久| 在线观看一区二区三区激情| 国产av国产精品国产| 日韩一本色道免费dvd| 欧美成人午夜免费资源| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品乱久久久久久| 在线天堂中文资源库| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久伊人网av| 欧美人与善性xxx| 在现免费观看毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人午夜福利电影在线观看| 最近手机中文字幕大全| 婷婷色综合大香蕉| 两个人免费观看高清视频| 久久精品国产综合久久久 | 新久久久久国产一级毛片| 天堂8中文在线网| 天天操日日干夜夜撸| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产一级毛片在线| 免费av中文字幕在线| 熟女电影av网| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费高清在线观看日韩| 婷婷色av中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 全区人妻精品视频| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久人妻精品一区果冻| 大话2 男鬼变身卡| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久热在线av| 中文天堂在线官网| 精品亚洲成a人片在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品视频女| 少妇精品久久久久久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产免费又黄又爽又色| 好男人视频免费观看在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 国产精品人妻久久久影院| 国产免费现黄频在线看|