常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)一例及其家系基因突變研究

王沛 周城 王雨馨 溫廣東 劉萍 于聰 廖文俊 張建中

常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)一例及其家系基因突變研究

王沛 周城 王雨馨 溫廣東 劉萍 于聰 廖文俊 張建中

目的 報(bào)道國(guó)內(nèi)首例常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，對(duì)患者及其父母橋粒芯糖蛋白4編碼基因（DSG4）進(jìn)行突變研究。方法 抽取1例念珠狀發(fā)患兒及其父母外周血，提取血液基因組DNA，同時(shí)取100例健康漢族人基因組DNA樣品作對(duì)照，采用PCR方法擴(kuò)增DSG4基因16個(gè)外顯子，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果 患兒DSG4基因存在2個(gè)雜合突變，突變1為第8外顯子移位突變c.837delA（p.E280Rfs*4），突變2為第16外顯子無(wú)義突變c.2389C＞T（p.R797*）。對(duì)其父母的基因分析證明，突變1來(lái)自其父親，突變2來(lái)自其母親。100例健康對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)該雜合突變。結(jié)論 DSG4基因的2個(gè)雜合突變c.837delA（p.E280Rfs*4）和c.2389C＞T（p.R797*）導(dǎo)致該常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)家系的臨床表型，2個(gè)突變均導(dǎo)致DSG4基因翻譯的提前終止。

念珠形發(fā)；稀毛癥；皮膚疾病,遺傳性；橋粒芯糖蛋白質(zhì)類；突變；橋粒芯糖蛋白4基因

念珠狀發(fā)（monilethrix，OMIM：158000）是一種罕見的毛干結(jié)構(gòu)異常伴毛囊改變的先天性禿發(fā)癥，屬于單基因遺傳性疾病。念珠狀發(fā)多以常染色體顯性方式遺傳，已發(fā)現(xiàn)常染色體顯性遺傳念珠狀發(fā)的致病基因?yàn)?種Ⅱ型毛發(fā)角蛋白的編碼基因：KRTHB1（KRT81）、KRTHB3（KRT83）和 KRTHB6（KRT86），國(guó)內(nèi)外已有多個(gè)家系報(bào)道證實(shí)［1-2］。近年來(lái)，國(guó)外報(bào)道了數(shù)例以常染色體隱性遺傳伴有念珠狀發(fā)樣改變的先天性稀毛癥家系，部分學(xué)者將其命名為常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，并發(fā)現(xiàn)其致病基因?yàn)闃蛄Ｐ咎堑鞍?4（desmoglein 4，DSG4）編碼基因［3］。目前常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)在國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道，本文報(bào)道1例常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，并對(duì)其進(jìn)行DSG4基因的突變研究。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

先證者男，11歲，漢族?；純撼錾鷷r(shí)頭皮正常，無(wú)頭發(fā)，出生后逐漸有少量頭發(fā)長(zhǎng)出，睫毛、眉毛正常。8個(gè)月大時(shí)頭皮開始出現(xiàn)針尖樣丘疹，與毛囊分布一致，其上毛發(fā)變細(xì)、斷裂，留下毛囊角化性丘疹，類似的皮損也逐漸增多并擴(kuò)展至頸部和四肢伸側(cè)。1歲余時(shí)睫毛和眉毛開始脫落、變短，顏色變淡，逐漸出現(xiàn)和頭皮類似的毛囊角化性丘疹。脫發(fā)情況春重冬輕。指（趾）甲正常，齲齒較多，牙齒上有裂紋。外院曾診為小棘狀毛壅癥，使用中藥及抗真菌藥物治療無(wú)效?；純荷L(zhǎng)發(fā)育與同齡兒無(wú)異，身高、體重、智力均正常。父母均體健，非近親結(jié)婚，家族中無(wú)類似疾病患者。皮膚科檢查：頭發(fā)稀疏，頭皮、頸部可見成片的毛囊性丘疹，針頭大小，中央可見一黑色角栓，剝出角栓可見其內(nèi)含有碎毛，毛囊周圍可見紅斑；眉毛和睫毛稀疏、短?。▓D1、2）；脫落的頭發(fā)無(wú)毛囊，多為從毛干下部斷裂形成的斷發(fā)。光鏡下可見部分頭發(fā)粗細(xì)不均，頭發(fā)彎折、斷裂。牙齒無(wú)光澤，有裂紋，指（趾）甲正常。皮膚鏡下可見黑點(diǎn)征樣改變，粗大的毛發(fā)大致正常，部分頭發(fā)細(xì)小、折斷，可見串珠樣改變（圖3、4）。父母毛發(fā)密度和分布均正常。初步診斷：念珠狀發(fā)。

對(duì)照組100例來(lái)自于北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科收集的無(wú)先天性禿發(fā)表現(xiàn)或家族史的正常人，均為漢族。

圖1 患者頭皮毛發(fā)和眉毛稀疏、短小

圖2 患者后頸部散在片狀毛囊角化性丘疹，毛囊周圍可見紅斑

圖3 皮膚鏡下可見大量斷發(fā)，黑點(diǎn)征樣改變（×10）

圖4 部分細(xì)小毛發(fā)可見串珠樣改變（×20）

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.DNA提取：受檢者簽署知情同意書后，取家系先證者及其父母外周血5ml，2%乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，使用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司）提取基因組DNA。

2.PCR及測(cè)序：擴(kuò)增DSG4基因片段，按照文獻(xiàn)［4］提供的序列合成DSG4基因特異性PCR引物，共15對(duì)，覆蓋DSG4基因所有16個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列。以基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，采用50μl體系，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性7min后，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

3.DSG4基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收純化后，送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法（Sanger法）。測(cè)序結(jié)果采用 BLAST軟件及DNAMAN6.0軟件與DSG4基因序列進(jìn)行比對(duì)。

4.驗(yàn)證：100例毛發(fā)正常受試者每例取外周血3ml作為對(duì)照組，按上述方法提取基因組DNA，并擴(kuò)增患者發(fā)生突變的相應(yīng)外顯子進(jìn)行測(cè)序。

結(jié) 果

所有引物在模板DNA中均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，產(chǎn)物切膠純化后測(cè)序，結(jié)果清晰無(wú)雜峰干擾。將所測(cè)得的序列與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://genome.ucsc.edu）公布的正常序列進(jìn)行對(duì)比，排除已知單核苷酸多態(tài)性（SNP）之后得到如下結(jié)果：先證者第8外顯子存在1個(gè)雜合移碼突變c.837delA（p.E280Rfs*4）（突變1），該突變導(dǎo)致第280位密碼子由GAG變?yōu)锳GA，并在其后形成翻譯提前終止密碼子（PTC）；第16外顯子存在一雜合突變c.2389C＞T（p.R797*）（突變2），導(dǎo)致第797位密碼子CGA變成了TGA，編碼的氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼，形成另一處PTC。測(cè)序結(jié)果見圖5。

隨后對(duì)先證者父母DSG4基因突變進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其父親存在c.837delA（p.E280Rfs*4），母親存在c.2389C＞T（p.R797*），先證者DSG4的2個(gè)突變分別來(lái)自于其父母。在100例健康對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)此雜合突變。測(cè)序結(jié)果見圖5。

圖5 DSG4第8和第16號(hào)外顯子測(cè)序結(jié)果 A：患兒第8號(hào)外顯子c.837delA突變；B：其父第8號(hào)外顯子c.837delA突變；C：第8號(hào)外顯子健康對(duì)照；D：患兒第16號(hào)外顯子c.2389C＞T突變；E：其母第16號(hào)外顯子c.2389C＞T突變；F：第16號(hào)外顯子健康對(duì)照

討 論

本文報(bào)道國(guó)內(nèi)首例DSG4基因突變所致的常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，在使用毛發(fā)鏡和突變分析前該患者長(zhǎng)期被誤診為小棘狀毛壅癥。臨床診斷念珠狀發(fā)的關(guān)鍵是找到典型的發(fā)干結(jié)構(gòu)改變，但由于念珠狀發(fā)脆性增加，所以通常有明顯異常的毛干在長(zhǎng)出頭皮不久即在近毛根處發(fā)生斷裂，尤其是當(dāng)發(fā)生典型念珠狀發(fā)改變的毛發(fā)比例較少時(shí)，采集進(jìn)行光鏡或掃描電鏡檢查的較長(zhǎng)頭發(fā)往往因外觀正常而容易漏診。常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)的典型念珠狀發(fā)改變常常僅發(fā)生于非常細(xì)小的頭發(fā)，更易漏診和誤診。

過去認(rèn)為念珠狀發(fā)為常染色體顯性遺傳，其致病基因?yàn)?種角蛋白基因 KRT81、KRT83和KRT86。近年來(lái)國(guó)際上相繼報(bào)道了數(shù)例常染色體隱性遺傳的念珠狀發(fā)，并發(fā)現(xiàn)其致病基因?yàn)闃蛄Ｐ咎堑鞍?［4］。橋粒是角質(zhì)形成細(xì)胞間連接的基本結(jié)構(gòu)，橋粒芯糖蛋白是其組成部分之一。毛囊細(xì)胞的分化需要骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多種分子通路的參與，細(xì)胞間的聯(lián)接網(wǎng)絡(luò)為這些信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化提供了最基礎(chǔ)的保障［5］。2003年 Whittock 等［6］從基因水平定位描述了一個(gè)和橋粒芯糖蛋白1、2、3同源的新人類橋粒芯糖蛋白，并將其命名為橋粒芯糖蛋白4，其編碼基因?yàn)镈SG4基因，DSG4位于18號(hào)染色體18q12、DSG1與DSG3的編碼基因之間，由16個(gè)外顯子組成，cDNA全長(zhǎng)3.6 kb。

DSG4屬于鈣黏蛋白超家族，是橋粒的重要部分，常在表皮和毛囊表達(dá)。Kljuic等［5］最早通過兩個(gè)巴基斯坦家系的研究發(fā)現(xiàn)，DSG4的突變導(dǎo)致局限性常染色體隱性遺傳性稀毛癥（localized autosomal recessive hypotrichosis,LAH）的發(fā)病。LAH臨床表現(xiàn)和常染色體顯性遺傳念珠狀發(fā)相似，但病發(fā)毛干在電鏡下未發(fā)現(xiàn)念珠狀結(jié)構(gòu)。2006年Shimomura等［4］、Zlotogorski等［7］和 Schaffer等［8］分別報(bào)道了 DSG4 基因突變導(dǎo)致的伴串珠樣結(jié)構(gòu)異常的先天性禿發(fā)病例，其臨床表現(xiàn)與常染色體顯性遺傳念珠狀發(fā)也非常相似，篩查Ⅱ型角蛋白基因結(jié)果為陰性，后將該病命名為念珠狀發(fā)樣先天性稀毛癥。近年來(lái)部分學(xué)者認(rèn)為該病為念珠狀發(fā)的一種常染色體隱性遺傳的亞型。由于常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)和LAH的致病基因均為DSG4，臨床表現(xiàn)非常相似，差異僅為毛干是否存在念珠狀發(fā)樣改變，這兩種疾病是否實(shí)為同一疾病，尚存在爭(zhēng)議。Wajid等［9］報(bào)道的LAH家系中雖沒有出現(xiàn)典型的念珠樣發(fā)，但毛干偶爾也可以觀察到念珠發(fā)樣的凸起結(jié)構(gòu)。我們認(rèn)為常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)和LAH是同一種疾病，使用皮膚鏡能比電鏡更容易發(fā)現(xiàn)細(xì)小的、比例較少的、有念珠狀發(fā)樣改變的毛發(fā)，但還需要更多的病例報(bào)告和突變研究來(lái)證實(shí)。

目前我們所知，與常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)和LAH相關(guān)的DSG4基因突變共11種，包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、堿基的缺失突變、插入突變、剪接位點(diǎn)突變和大片段缺失突變等［4，7-13］（圖6）。其中LAH的DSG4基因突變報(bào)道都為純合子突變，念珠狀發(fā)幾乎均為雜合子突變（僅1例純合P267R突變例外）。不同的突變位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致臨床癥狀的表現(xiàn)不一，純合突變癥狀相對(duì)較重，有明顯的臨床異質(zhì)性。本研究中突變c.837delA和c.2389C＞T分別發(fā)生在細(xì)胞外第3結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（圖6）。根據(jù)Peltz等［14］提出的無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解原則（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），異常 mRNA將被細(xì)胞識(shí)別并清除，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PTC下游至少有一個(gè)外顯子-外顯子連接（exon-exon junction，EEJ）才能啟動(dòng)清除［15］。本文患者的第1 個(gè)PTC位于第8外顯子，根據(jù)該定律，其翻譯產(chǎn)物將被大量降解，不會(huì)形成蛋白產(chǎn)物。第2個(gè)PTC位于第16外顯子，由于位于基因最末外顯子，所以我們認(rèn)為它很可能躲避NMD監(jiān)控而形成一個(gè)縮短的產(chǎn)物，從而保留部分DSG4的功能，因此臨床表現(xiàn)相對(duì)較輕，該突變導(dǎo)致橋粒芯糖蛋白C-端結(jié)構(gòu)的缺失，影響DSG和橋粒斑珠蛋白（PG）的連接，導(dǎo)致細(xì)胞間連接系統(tǒng)的缺陷［16］。

圖6 DSG4結(jié)構(gòu)域模式圖及已經(jīng)報(bào)道過的突變位點(diǎn)。其中S為信號(hào)結(jié)構(gòu)域，P為前蛋白結(jié)構(gòu)域，ECⅠ～ECⅣ為細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，EA為細(xì)胞外錨定結(jié)構(gòu)域，TM為跨膜結(jié)構(gòu)域，IC為細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。a：為本家系新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)突變位點(diǎn)

本研究在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道常染色體隱性遺傳念珠狀發(fā)，并通過對(duì)其進(jìn)行基因突變分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)DSG4基因的新突變，c.837delA和c.2389C＞T，豐富了該病的遺傳及臨床數(shù)據(jù)庫(kù)，并為該病臨床上的正確診斷、將來(lái)基因型與表型的相互關(guān)系研究以及DSG4在毛囊生長(zhǎng)中的功能研究提供了依據(jù)。

［1］Ferrando J,Galve J,Torres-Puente M,et al.Monilethrix:a new family with the novel mutation in KRT81 gene［J］.Int J Trichology,2012,4（1）:53-55.

［2］李建國(guó),李振魯,王豫平.念珠狀發(fā)家系毛發(fā)角蛋白6致病基因的檢測(cè)［J］.中華皮膚科雜志,2006,39（7）:374-376.

［3］Schweizer J.More than one gene involved in monilethrix:intracellular but also extracellular players［J］.J Invest Dermatol,2006,126（6）:1216-1219.

［4］Shimomura Y,Sakamoto F,Kariya N,et al.Mutations in the desmoglein 4 gene are associated with monilethrix-like congenital hypotrichosis［J］.J Invest Dermatol,2006,126（6）:1281-1285.

［5］Kljuic A,Bazzi H,Sundberg JP,et al.Desmoglein 4 in hair follicle differentiation and epidermal adhesion:evidence from inherited hypotrichosis and acquired pemphigus vulgaris［J］.Cell,2003,113（2）:249-260.

［6］Whittock NV,Bower C.Genetic evidence for a novel human desmosomal cadherin,desmoglein 4［J］.J Invest Dermatol,2003,120（4）:523-530.

［7］Zlotogorski A,Marek D,Horev L,et al.An autosomal recessive form of monilethrix is caused by mutations in DSG4:clinical overlap with localized autosomal recessive hypotrichosis ［J］.J Invest Dermatol,2006,126（6）:1292-1296.

［8］Schaffer JV,Bazzi H,Vitebsky A,et al.Mutations in the desmoglein 4 gene underlie localized autosomal recessive hypotrichosis with monilethrix hairs and congenital scalp erosions ［J］.J Invest Dermatol,2006,126（6）:1286-1291.

［9］Wajid M,Bazzi H,Rockey J,et al.Localized autosomal recessive hypotrichosis due to a frameshift mutation in the desmoglein 4 gene exhibits extensive phenotypic variability within a Pakistani family［J］.J Invest Dermatol,2007,127（7）:1779-1782.

［10］Moss C,Martinez-Mir A,Lam H,et al.A recurrent intragenic deletion in the desmoglein 4 gene underlies localized autosomal recessive hypotrichosis［J］.J Invest Dermatol,2004,123（3）:607-610.

［11］Rafiq MA,Ansar M,Mahmood S,et al.A recurrent intragenic deletion mutation in DSG4 gene in three Pakistani families with autosomal recessive hypotrichosis［J］.J Invest Dermatol,2004,123（1）:247-248.

［12］Messenger AG,Bazzi H,Parslew R,et al.A missense mutation in the cadherin interaction site of the desmoglein 4 gene underlies localized autosomal recessive hypotrichosis［J］.J Invest Dermatol,2005,125（5）:1077-1079.

［13］Farooq M,Ito M,Naito M,et al.A case of monilethrix caused by novel compound heterozygous mutations in the desmoglein 4（DSG4）gene［J］.Br J Dermatol,2011,165（2）:425-431.

［14］Peltz SW,Brown AH,Jacobson A.mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on at least three cis-acting sequence elements and one trans-acting factor［J］.Genes Dev,1993,7（9）:1737-1754.

［15］Lewis BP,Green RE,Brenner SE.Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100（1）:189-192.

［16］Troyanovsky SM,Troyanovsky RB,Eshkind LG,et al.Identification of the plakoglobin-binding domain in desmoglein and its role in plaque assembly and intermediate filament anchorage ［J］.J Cell Biol,1994,127（1）:151-160.

2014-05-05）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

Autosomal recessive monilethrix:a case report and mutation analysis

Wang Pei*,Zhou Cheng,Wang Yuxin,Wen Guangdong,Liu Ping,Yu Cong,Liao Wenjun,Zhang Jianzhong.*Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital,Beijing 100044,China

Zhang Jianzhong,Email:rmzjz@126.com

ObjectiveTo report the first case of autosomal recessive monilethrix in China,and to study the mutations in the desmoglein 4 （DSG4）gene in the patient and his parents.MethodsPeripheral blood samples were obtained from an 11-year-old boy with monilethrix,his parents and 100 healthy human controls of Han nationality.Genomic DNA was extracted from these samples,and PCR was performed to amplify 16 exons of the DSG4 gene followed by DNA sequencing.ResultsThere were 2 heterozygous mutations in the DSG4 gene in the patient,including a translocation mutation c.837delA（p.E280Rfs*4）in exon 8 and a nonsense mutation c.2389C ＞ T（p.R797*）in exon 16.Gene analysis in the parents revealed that the translocation mutation and nonsense mutation were inherited from the father and mother respectively.Neither of the two mutations was found in the 100 healthy controls.ConclusionsThe two heterozygous mutations c.837delA （p.E280Rfs*4）and c.2389C ＞T （p.R797*）in the DSG4 gene,both of which lead to premature termination of translation of the DSG4 gene,may be responsible for the clinical phenotype of autosomal recessive monilethrix in this family.

Monilethrix;Hypotrichosis;Skin diseases,genetic;Desmogleins;Mutation;Desmoglein 4 gene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201221）

100044北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科（王沛、周城、王雨馨、溫廣東、劉萍、于聰、張建中）；第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院（廖文?。?/p>

張建中，Email：rmzjz@126.com