古代三合土灰漿中蛋清的酶聯(lián)免疫檢測(cè)研究

張秉堅(jiān)，胡文靜，張 坤，方世強(qiáng)

（1.浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310027；2.浙江大學(xué) 文物與博物館學(xué)系，浙江 杭州 310027）

能反映古代建筑原始工藝和保存狀態(tài)的重要材料之一是膠凝材料.在中國(guó)古代，石灰是應(yīng)用最廣泛的無(wú)機(jī)膠凝材料，至少可以追溯到公元前5 000年～公元前3 000 年［1］，蛋清［2］、動(dòng)物血、糯米等是當(dāng)時(shí)經(jīng)常使用的有機(jī)膠凝材料.

筆者曾比較系統(tǒng)地研究了糯米灰漿［3－8］、桐油灰漿［9－11］、血料灰漿［12］的作用機(jī)理，并已研發(fā)出1套從古代遺存物中檢測(cè)微量有機(jī)膠凝材料（包括：淀粉、蛋白質(zhì)、油脂、動(dòng)物血、糖分）的化學(xué)分析方法［13］.但是，當(dāng)被檢樣品中含有干擾色（例如黃土），利用顏色鑒別成分的化學(xué)分析方法就難以進(jìn)行.此外，用于有機(jī)成分檢測(cè)的紅外光譜法，由于灰漿中SiO2的紅外吸收峰與有機(jī)物的紅外吸收峰在1 000～1 200cm－1處重疊［4］，難以分辨，導(dǎo)致該法也不能進(jìn)行有效、準(zhǔn)確的鑒別.為了研究蛋清和蛋清灰漿的應(yīng)用歷史及作用機(jī)理，如何避免顏色干擾？如何在蛋白質(zhì)大類(lèi)分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定蛋清成分就成為必須解決的技術(shù)問(wèn)題.能夠從復(fù)雜樣品中準(zhǔn)確檢測(cè)蛋清的有效方法是免疫法，例如利用卵清蛋白抗體與樣品中殘留抗原結(jié)合的特異性，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）來(lái)檢測(cè)蛋清成分［14－15］.

Arlen等［16］應(yīng)用ELISA檢測(cè)出17世紀(jì)法國(guó)櫥柜上繪畫(huà)顏料的膠結(jié)物為蛋清；Laura 等［17］應(yīng) 用ELISA，在公元前200年～公元50年的古埃及遺存和17世紀(jì)意大利圣弗朗西斯教堂壁畫(huà)中檢測(cè)出了雞蛋成分；美國(guó)蓋蒂保護(hù)所（GCI）也采用ELISA 鑒定出古埃及木乃伊棺材殘片中使用的動(dòng)物膠、植物膠和雞蛋［18］.以免疫法為核心的檢測(cè)技術(shù)具有很高的特異性和靈敏度，但是，該技術(shù)還沒(méi)有應(yīng)用于古代灰漿等檢測(cè)的報(bào)道.雖然古代灰漿成分復(fù)雜，但只要用過(guò)蛋清，就會(huì)或多或少有所殘留.本文針對(duì)蛋清蛋白抗原，采用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，其基本原理（見(jiàn)圖1）是利用涂布于孔板固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與被檢樣品中抗原分子上2個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固體相抗體－抗原－酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物，該復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成正比，測(cè)定其中的有色物質(zhì)量（OD值），即可確定待測(cè)抗原的含量.

圖1 ELISA 基本原理示意圖Fig.1 Basic principle of enzyme－linked immunosorbent assay

1 試劑、儀器和樣品制備

試劑為RIDASCREEN? FAST Ei／Egg Protein（R6402）試劑盒，HCl和NaOH 溶液.在波長(zhǎng)λ＝450nm的條件下，采用R－Biopharm WeLL Reader酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的光密度OD450nm.

綜合中國(guó)古代灰漿的各類(lèi)無(wú)機(jī)成分，在實(shí)驗(yàn)室模擬制作了3 個(gè)系列的蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品：（a）Ca（OH）2＋黏土（二者的質(zhì)量比為1∶1）；（b）黏土；（c）CaCO3粉末.為考察檢測(cè)限和準(zhǔn)確性，本文制備了6種蛋清濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）水溶液.將水溶液與灰土按質(zhì)量比0.8混合制作成標(biāo)準(zhǔn)樣品，在自然條件下老化6個(gè)月后備用.蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品中的蛋清濃度見(jiàn)表1.

表1 蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品中的蛋清濃度Table 1 Concentrations of egg white in standard egg white mortar samples

10個(gè)蛋清灰漿樣品分別為浙江、河南、吉林、甘肅和北京的古城墻或古墓葬灰漿及壁畫(huà)地仗層.蛋清灰漿樣品的具體情況見(jiàn)表2.

2 試驗(yàn)部分

2.1 ELISA

2.1.1 樣品處理

所有樣品均經(jīng)過(guò)粉碎、研磨并充分混合.稱(chēng)取少量樣品（約0.1g），加入適量提取緩沖液，在60℃條件下用超聲波處理10min，冷卻后將其置于高速離心機(jī)中離心10min，取上清液調(diào)節(jié)pH 值為7備用.

2.1.2 檢測(cè)過(guò)程

（1）將所需數(shù)量的孔條插入微孔板架，并記錄下各個(gè)樣品所在位置.（2）將100μL 待測(cè)樣品上清液加入到相應(yīng)的微孔中，在室溫（20～25℃）條件下孵育10min.（3）倒出微孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去微孔中的液體，然后在每個(gè)微孔中加入250μL洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌.（4）在每個(gè)微孔中加入100μL稀釋后的酶連接物溶液，充分混合，在室溫（20～25℃）條件下孵育10min.（5）倒出微孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體，然后在每個(gè)微孔中加入250 μL 洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌.（6）在每個(gè)微孔中加入100μL底物／發(fā)色劑，充分混合后在室溫（20～25 ℃）條件下暗處孵育10 min.（7）在每個(gè)微孔中加入100μL 反應(yīng)終止液，充分混合，再加入反應(yīng)終止液，10min內(nèi)于450nm 處測(cè)量OD450nm.（8）每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，OD450nm取平均值.

表2 蛋清灰漿樣品Table 2 Ancient mortar samples

2.2 化學(xué)分析法

作為對(duì)照，先用試劑考馬斯亮藍(lán)G－250對(duì)10個(gè)蛋清灰漿樣品進(jìn)行化學(xué)分析檢測(cè)，詳細(xì)步驟見(jiàn)文獻(xiàn)［13］.

3 結(jié)果與討論

3.1 蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品分析結(jié)果

3.1.1 ELISA 分析結(jié)果

對(duì)于大多數(shù)免疫檢測(cè)來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性樣品與陰性樣品之間存在1個(gè)檢測(cè)結(jié)果的重疊區(qū).為了提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性，選擇合適的臨界值至關(guān)重要.本文利用試劑盒中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)試，以確定同等試驗(yàn)條件下檢測(cè)的臨界值，結(jié)果見(jiàn)表3，4.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.5mg／kg的OD450nm值大約為0mg／kg的OD450nm值2.6倍，滿(mǎn)足臨界值＝陰性對(duì)照×2.1（或＋，－定值）的要求，故本文取檢測(cè)臨界值為0.228.

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組的OD450nm值均低于臨界值.可見(jiàn)，ELISA 具有較高的特異性，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果.

綜合中國(guó)古代常見(jiàn)建筑灰漿中出現(xiàn)的各類(lèi)無(wú)機(jī)成分，本文重點(diǎn)考察了Ca（OH）2與土混合系列、黏土系列、CaCO3系列無(wú)機(jī)物中不同濃度的蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，以確定ELISA 的靈敏度.不同系列不同濃度蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品的ELISA 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5.由表5可見(jiàn)，3個(gè)系列蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品空白對(duì)照組的OD450nm值均低于臨界值，其他濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD450nm值均高于臨界值，這說(shuō)明ELISA 具有較高的靈敏度和很低的檢測(cè)限，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品最低蛋清濃度（0.003%）的檢測(cè).此外，從3類(lèi)無(wú)機(jī)物檢測(cè)結(jié)果可以看出，ELISA 不受灰土本身顏色的干擾，完全克服了考馬斯亮藍(lán)化學(xué)分析法受顏色影響的缺陷，解決了蛋清灰漿樣品中蛋清成分的分析檢測(cè)問(wèn)題.

表3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 3 ELISA result in the standard protein samples

表4 陰性對(duì)照組的ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 4 ELISA result in the negative controls

表5 不同系列不同濃度蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品的ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 5 ELISA result in different series and concentrations of egg white standard samples

3.1.2 化學(xué)分析結(jié)果

作為對(duì)照，本文采用考馬斯亮藍(lán)化學(xué)分析法檢測(cè)了蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，結(jié)果如圖2所示.對(duì)于a系列，化學(xué)分析檢測(cè)蛋清的檢測(cè)限為0.201%～0.808%（見(jiàn)圖2（a））；對(duì)于b系列，幾乎無(wú)法觀察到明顯的顏色變化（見(jiàn)圖2（b））；對(duì)于c系列，因樣品中不含灰土，檢測(cè)限為0.201%～0.808%（見(jiàn)圖2（c））.由此可見(jiàn)，當(dāng)?shù)扒寤覞{中含有灰土?xí)r，由于受其顏色的干擾，使化學(xué)分析法檢測(cè)蛋清的靈敏度較低.

3.2 清蛋灰漿樣品檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 化學(xué)分析檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于10個(gè)清蛋灰漿樣品，首先采用考馬斯亮藍(lán)化學(xué)分析法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5.由于含有灰土，所有考馬斯亮藍(lán)溶液顏色較深，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果難以準(zhǔn)確判斷.

3.2.2 ELISA 檢測(cè)結(jié)果

以空白對(duì)照組樣品的OD450nm值校零，當(dāng)待測(cè)樣品的OD450nm值高于臨界值時(shí)定為陽(yáng)性，低于臨界值時(shí)定為陰性.

按照2.1.1和2.1.2，采用ELISA 對(duì)10個(gè)蛋清灰漿樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6.由表6 可見(jiàn)，莫高窟85窟掉落地仗、杭州六和塔灰漿、莫高窟26窟掉落地仗、東北某墓葬地仗的OD450nm值處于臨界值的上緣，即檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，表明這4 個(gè)樣品中含有蛋清蛋白，其中莫高窟85 窟掉落地仗樣品的OD450nm值最高，含有蛋清成分的可靠性最大.而河南開(kāi)封城墻灰漿、浙江安吉孝豐城墻灰漿等6個(gè)樣品的OD450nm值均低于臨界值，即檢測(cè)結(jié)果呈陰性，表明這6個(gè)樣品中沒(méi)有蛋清蛋白存在.

圖2 蛋清灰漿標(biāo)準(zhǔn)樣品的化學(xué)檢測(cè)Fig.2 Results of chemical analyses on simulated egg white standard mortars with inorganic binders of a，b and c（from left to right are mortars with concentration 3.333%，0.808%，0.201%，0.048%，0.012%，and 0.003%）

表6 蛋清灰漿樣品檢測(cè)結(jié)果Table 6 Texting results of ancient mortar samples

大多數(shù)蛋清灰漿樣品均經(jīng)過(guò)了上千年的風(fēng)吹雨打，能殘留的有機(jī)膠凝物自然很少.針對(duì)這類(lèi)微量有機(jī)成分的檢測(cè)，需要靈敏更高、特異性更強(qiáng)的方法，免疫分析法不失為最佳選擇.通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法和ELISA 對(duì)10 個(gè)蛋清灰漿樣品的檢測(cè)結(jié)果比較可見(jiàn)，ELISA 不僅靈敏度更高，而且克服了灰土顏色的干擾，同時(shí)還可將目標(biāo)蛋白質(zhì)從其他蛋白類(lèi)物質(zhì)中鑒別出來(lái)，準(zhǔn)確檢測(cè)出其中的蛋清成分，在檢測(cè)的特異性方面有了較大突破，非常適合于蛋清灰漿樣品中蛋清的分析檢測(cè).

4 結(jié)論

本文利用抗原－抗體免疫反應(yīng)的高特異性和靈敏度，采用ELISA 首次實(shí)現(xiàn)了蛋清灰漿樣品中微量蛋清成分的準(zhǔn)確檢測(cè).ELISA 檢測(cè)蛋清的最低檢出濃度為0.003%，解決了化學(xué)分析法檢測(cè)時(shí)容易受樣品中灰土顏色干擾的問(wèn)題，在蛋清檢測(cè)的特異性方面有較大的突破，為研究蛋清灰漿的成分提供了有效檢測(cè)技術(shù).

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