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    古代三合土灰漿中蛋清的酶聯(lián)免疫檢測研究

    2015-11-28 08:40:24張秉堅胡文靜方世強
    建筑材料學報 2015年4期
    關鍵詞:標準檢測

    張秉堅,胡文靜,張 坤,方世強

    (1.浙江大學 化學系,浙江 杭州 310027;2.浙江大學 文物與博物館學系,浙江 杭州 310027)

    能反映古代建筑原始工藝和保存狀態(tài)的重要材料之一是膠凝材料.在中國古代,石灰是應用最廣泛的無機膠凝材料,至少可以追溯到公元前5 000年~公元前3 000 年[1],蛋清[2]、動物血、糯米等是當時經常使用的有機膠凝材料.

    筆者曾比較系統(tǒng)地研究了糯米灰漿[3-8]、桐油灰漿[9-11]、血料灰漿[12]的作用機理,并已研發(fā)出1套從古代遺存物中檢測微量有機膠凝材料(包括:淀粉、蛋白質、油脂、動物血、糖分)的化學分析方法[13].但是,當被檢樣品中含有干擾色(例如黃土),利用顏色鑒別成分的化學分析方法就難以進行.此外,用于有機成分檢測的紅外光譜法,由于灰漿中SiO2的紅外吸收峰與有機物的紅外吸收峰在1 000~1 200cm-1處重疊[4],難以分辨,導致該法也不能進行有效、準確的鑒別.為了研究蛋清和蛋清灰漿的應用歷史及作用機理,如何避免顏色干擾?如何在蛋白質大類分析的基礎上進一步準確鑒定蛋清成分就成為必須解決的技術問題.能夠從復雜樣品中準確檢測蛋清的有效方法是免疫法,例如利用卵清蛋白抗體與樣品中殘留抗原結合的特異性,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來檢測蛋清成分[14-15].

    Arlen等[16]應用ELISA檢測出17世紀法國櫥柜上繪畫顏料的膠結物為蛋清;Laura 等[17]應 用ELISA,在公元前200年~公元50年的古埃及遺存和17世紀意大利圣弗朗西斯教堂壁畫中檢測出了雞蛋成分;美國蓋蒂保護所(GCI)也采用ELISA 鑒定出古埃及木乃伊棺材殘片中使用的動物膠、植物膠和雞蛋[18].以免疫法為核心的檢測技術具有很高的特異性和靈敏度,但是,該技術還沒有應用于古代灰漿等檢測的報道.雖然古代灰漿成分復雜,但只要用過蛋清,就會或多或少有所殘留.本文針對蛋清蛋白抗原,采用ELISA進行檢測,其基本原理(見圖1)是利用涂布于孔板固相載體上的抗體和酶標抗體分別與被檢樣品中抗原分子上2個抗原決定簇結合,形成固體相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物,該復合物的形成量與待測抗原的含量成正比,測定其中的有色物質量(OD值),即可確定待測抗原的含量.

    圖1 ELISA 基本原理示意圖Fig.1 Basic principle of enzyme-linked immunosorbent assay

    1 試劑、儀器和樣品制備

    試劑為RIDASCREEN? FAST Ei/Egg Protein(R6402)試劑盒,HCl和NaOH 溶液.在波長λ=450nm的條件下,采用R-Biopharm WeLL Reader酶標儀檢測樣品的光密度OD450nm.

    綜合中國古代灰漿的各類無機成分,在實驗室模擬制作了3 個系列的蛋清灰漿標準樣品:(a)Ca(OH)2+黏土(二者的質量比為1∶1);(b)黏土;(c)CaCO3粉末.為考察檢測限和準確性,本文制備了6種蛋清濃度(質量分數(shù))水溶液.將水溶液與灰土按質量比0.8混合制作成標準樣品,在自然條件下老化6個月后備用.蛋清灰漿標準樣品中的蛋清濃度見表1.

    表1 蛋清灰漿標準樣品中的蛋清濃度Table 1 Concentrations of egg white in standard egg white mortar samples

    10個蛋清灰漿樣品分別為浙江、河南、吉林、甘肅和北京的古城墻或古墓葬灰漿及壁畫地仗層.蛋清灰漿樣品的具體情況見表2.

    2 試驗部分

    2.1 ELISA

    2.1.1 樣品處理

    所有樣品均經過粉碎、研磨并充分混合.稱取少量樣品(約0.1g),加入適量提取緩沖液,在60℃條件下用超聲波處理10min,冷卻后將其置于高速離心機中離心10min,取上清液調節(jié)pH 值為7備用.

    2.1.2 檢測過程

    (1)將所需數(shù)量的孔條插入微孔板架,并記錄下各個樣品所在位置.(2)將100μL 待測樣品上清液加入到相應的微孔中,在室溫(20~25℃)條件下孵育10min.(3)倒出微孔中的液體,將微孔板架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去微孔中的液體,然后在每個微孔中加入250μL洗滌緩沖液進行洗滌.(4)在每個微孔中加入100μL稀釋后的酶連接物溶液,充分混合,在室溫(20~25℃)條件下孵育10min.(5)倒出微孔中的液體,將微孔板架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體,然后在每個微孔中加入250 μL 洗滌緩沖液進行洗滌.(6)在每個微孔中加入100μL底物/發(fā)色劑,充分混合后在室溫(20~25 ℃)條件下暗處孵育10 min.(7)在每個微孔中加入100μL 反應終止液,充分混合,再加入反應終止液,10min內于450nm 處測量OD450nm.(8)每個樣品重復檢測3次,OD450nm取平均值.

    表2 蛋清灰漿樣品Table 2 Ancient mortar samples

    2.2 化學分析法

    作為對照,先用試劑考馬斯亮藍G-250對10個蛋清灰漿樣品進行化學分析檢測,詳細步驟見文獻[13].

    3 結果與討論

    3.1 蛋清灰漿標準樣品分析結果

    3.1.1 ELISA 分析結果

    對于大多數(shù)免疫檢測來說,陽性樣品與陰性樣品之間存在1個檢測結果的重疊區(qū).為了提高檢測方法的靈敏度和特異性,選擇合適的臨界值至關重要.本文利用試劑盒中不同濃度的標準蛋白樣品進行預測試,以確定同等試驗條件下檢測的臨界值,結果見表3,4.試驗發(fā)現(xiàn),0.5mg/kg的OD450nm值大約為0mg/kg的OD450nm值2.6倍,滿足臨界值=陰性對照×2.1(或+,-定值)的要求,故本文取檢測臨界值為0.228.

    檢測發(fā)現(xiàn),陰性對照組的OD450nm值均低于臨界值.可見,ELISA 具有較高的特異性,不會出現(xiàn)假陽性結果.

    綜合中國古代常見建筑灰漿中出現(xiàn)的各類無機成分,本文重點考察了Ca(OH)2與土混合系列、黏土系列、CaCO3系列無機物中不同濃度的蛋清灰漿標準樣品,以確定ELISA 的靈敏度.不同系列不同濃度蛋清灰漿標準樣品的ELISA 檢測結果見表5.由表5可見,3個系列蛋清灰漿標準樣品空白對照組的OD450nm值均低于臨界值,其他濃度標準樣品的OD450nm值均高于臨界值,這說明ELISA 具有較高的靈敏度和很低的檢測限,可以實現(xiàn)標準樣品最低蛋清濃度(0.003%)的檢測.此外,從3類無機物檢測結果可以看出,ELISA 不受灰土本身顏色的干擾,完全克服了考馬斯亮藍化學分析法受顏色影響的缺陷,解決了蛋清灰漿樣品中蛋清成分的分析檢測問題.

    表3 標準蛋白樣品的ELISA檢測結果Table 3 ELISA result in the standard protein samples

    表4 陰性對照組的ELISA檢測結果Table 4 ELISA result in the negative controls

    表5 不同系列不同濃度蛋清灰漿標準樣品的ELISA檢測結果Table 5 ELISA result in different series and concentrations of egg white standard samples

    3.1.2 化學分析結果

    作為對照,本文采用考馬斯亮藍化學分析法檢測了蛋清灰漿標準樣品,結果如圖2所示.對于a系列,化學分析檢測蛋清的檢測限為0.201%~0.808%(見圖2(a));對于b系列,幾乎無法觀察到明顯的顏色變化(見圖2(b));對于c系列,因樣品中不含灰土,檢測限為0.201%~0.808%(見圖2(c)).由此可見,當?shù)扒寤覞{中含有灰土時,由于受其顏色的干擾,使化學分析法檢測蛋清的靈敏度較低.

    3.2 清蛋灰漿樣品檢測結果

    3.2.1 化學分析檢測結果

    對于10個清蛋灰漿樣品,首先采用考馬斯亮藍化學分析法進行了檢測,結果見表5.由于含有灰土,所有考馬斯亮藍溶液顏色較深,導致檢測結果難以準確判斷.

    3.2.2 ELISA 檢測結果

    以空白對照組樣品的OD450nm值校零,當待測樣品的OD450nm值高于臨界值時定為陽性,低于臨界值時定為陰性.

    按照2.1.1和2.1.2,采用ELISA 對10個蛋清灰漿樣品進行了檢測,結果見表6.由表6 可見,莫高窟85窟掉落地仗、杭州六和塔灰漿、莫高窟26窟掉落地仗、東北某墓葬地仗的OD450nm值處于臨界值的上緣,即檢測結果呈陽性,表明這4 個樣品中含有蛋清蛋白,其中莫高窟85 窟掉落地仗樣品的OD450nm值最高,含有蛋清成分的可靠性最大.而河南開封城墻灰漿、浙江安吉孝豐城墻灰漿等6個樣品的OD450nm值均低于臨界值,即檢測結果呈陰性,表明這6個樣品中沒有蛋清蛋白存在.

    圖2 蛋清灰漿標準樣品的化學檢測Fig.2 Results of chemical analyses on simulated egg white standard mortars with inorganic binders of a,b and c(from left to right are mortars with concentration 3.333%,0.808%,0.201%,0.048%,0.012%,and 0.003%)

    表6 蛋清灰漿樣品檢測結果Table 6 Texting results of ancient mortar samples

    大多數(shù)蛋清灰漿樣品均經過了上千年的風吹雨打,能殘留的有機膠凝物自然很少.針對這類微量有機成分的檢測,需要靈敏更高、特異性更強的方法,免疫分析法不失為最佳選擇.通過考馬斯亮藍法和ELISA 對10 個蛋清灰漿樣品的檢測結果比較可見,ELISA 不僅靈敏度更高,而且克服了灰土顏色的干擾,同時還可將目標蛋白質從其他蛋白類物質中鑒別出來,準確檢測出其中的蛋清成分,在檢測的特異性方面有了較大突破,非常適合于蛋清灰漿樣品中蛋清的分析檢測.

    4 結論

    本文利用抗原-抗體免疫反應的高特異性和靈敏度,采用ELISA 首次實現(xiàn)了蛋清灰漿樣品中微量蛋清成分的準確檢測.ELISA 檢測蛋清的最低檢出濃度為0.003%,解決了化學分析法檢測時容易受樣品中灰土顏色干擾的問題,在蛋清檢測的特異性方面有較大的突破,為研究蛋清灰漿的成分提供了有效檢測技術.

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