豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定

謝 楊,張居作,彭 璇,左劍波,薛立群,※(.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙408；.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙403）

血管內(nèi)皮細(xì)胞對生理止血、血管通透性以及血管對生理病理刺激的反應(yīng)具有重要意義[1]。臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞是研究胎盤血管發(fā)生、血管生理病理的理想模型。臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)成為血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要來源，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)分離的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞有人[1-2]、豬[1]、犬[4]臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。臍帶易得，不易被污染，分離所得血管內(nèi)皮細(xì)胞純度高、損傷小、性質(zhì)穩(wěn)定、擴(kuò)增變異性小，主要有酶消化法、組織塊法和流式分選法[5-7]等。新生仔豬臍帶取材較易，靜脈血管較動脈血管粗，內(nèi)徑大，韌性好，便于操作，實(shí)驗采用1%的膠原酶灌注消化法分離豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用1 640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，驗證了通過Ⅰ型膠原酶消化豬臍靜脈提取血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法可行，獲得了SUVECs，為進(jìn)一步研究豬胎盤血管發(fā)生及其對母豬生產(chǎn)性能影響提供可靠細(xì)胞模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗樣本

自然分娩新生仔豬臍帶30條（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所種豬場）。

1.1.2 儀器試劑

超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；倒置顯微鏡（motic AE2000）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；冷凍型臺式大容量高速離心機(jī)（eppendorf 5810R），i-CELLigence實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀（艾森生物公司）。I型膠原酶溶液（Sigma公司），1640培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），青鏈霉素混合液（雙抗）、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（碧云天），兔抗人八因子相關(guān)抗原抗體（FⅧAg）、兔抗人CD31多克隆抗體、Cy3標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白IgG抗體（博士德生物）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離

采集自然分娩新生仔豬臍帶8～15cm，消毒棉線結(jié)扎兩端，放入預(yù)冷PBS緩沖液（含雙抗）中，冰盒保存，盡快（2h內(nèi)）轉(zhuǎn)移至實(shí)驗室；在超凈工作臺中，將臍帶放置于PBS緩沖液中清洗2～3次，使用75%乙醇浸泡15s進(jìn)行表面消毒，PBS清洗表層乙醇，轉(zhuǎn)入無菌玻璃平皿內(nèi)；使用滅菌眼科手術(shù)剪剪去兩端結(jié)扎處，組織縱向剝離，分離臍帶靜脈血管；灌注PBS沖洗血管內(nèi)腔直至流出的液體清亮透明無血色，再灌入適量空氣使靜脈血管腔內(nèi)無PBS液殘留；血管夾結(jié)扎靜脈血管一端，從另一端灌注1%的I型膠原酶溶液至血管微微膨脹，結(jié)扎注液端，置于預(yù)熱PBS液中37℃水浴消化10min。消化完全后，去掉血管夾，10%完全培養(yǎng)基沖洗血管內(nèi)腔，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min，4℃離心 7min，收集沉淀細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

收集的豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（swineumbilicusveinsendothelial cells,SUVECs）使用完全培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，置于6孔板中培養(yǎng)。24h半數(shù)換液，之后視細(xì)胞生長情況，2～3d換液，待細(xì)胞長至80%左右即可傳代。

1.2.3 細(xì)胞傳代

SUVECs細(xì)胞80%左右融合，棄上清，PBS液清洗2～3次，加入適量胰蛋白酶消化至培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞皺縮變圓彼此分離，完全培養(yǎng)基終止消化，按1:2傳代至新培養(yǎng)皿中，5代后按1：3傳代。

1.2.4 細(xì)胞鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況。（2）免疫熒光染色：設(shè)空白對照組（NC）、內(nèi)參對照組（PC）、VWF 實(shí)驗組（F8）和 CD31實(shí)驗組（CD），每組3個平行孔；1×105個/mL濃度接種24孔板，待細(xì)胞融合至70%～90%，棄掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗2～3次；4%多聚甲醛室溫固定 30min，PBST（ 含 0.05%的 Tween20） 洗 3 次，每次 5min；添加 0.1%Triton X-100，37℃破膜 30min， 再次使用PBST洗3次；正常山羊血清，37℃封閉1h；NC組、PC組、VWF實(shí)驗組和CD31實(shí)驗組按照100μL/孔分別加入PBS緩沖液、兔GAPDH抗體（1:1000倍稀釋）、兔VWF抗體（1:10倍稀釋）和兔CD31抗體（1:100倍稀釋），37℃孵育 2h，PBST洗 3次，每次5min；加入1%濃度的Cy3標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白IgG抗體，37℃避光孵育30min，PBST洗3次，每次5min；熒光顯微鏡觀察并照相。

1.2.5 細(xì)胞活力和生長曲線測定

培養(yǎng)細(xì)胞按照傳代方法制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度2.5×104個 /mL，以 300μL/孔接板于 i-CELLigence細(xì)胞功能分析儀E-Plate L8孔中，設(shè)置3個平行，實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞生長情況。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

第1代細(xì)胞中混有少量紅細(xì)胞，培養(yǎng)24h后細(xì)胞分布不均勻，簇狀生長，細(xì)胞呈小三角形、橢圓形、梭形、多邊形單層排列；培養(yǎng)3～5d后，細(xì)胞由中心向外擴(kuò)散增殖，細(xì)胞核清晰可見；培養(yǎng)7～9d，細(xì)胞逐漸融合成鋪路石狀，細(xì)胞間存在明顯的接觸抑制；隨著細(xì)胞代數(shù)增加，細(xì)胞生長速度增快，細(xì)胞接種后貼壁迅速，4～6h可見大部分細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞形態(tài)飽滿，生長旺盛，3～4d即可達(dá)90%融合，細(xì)胞傳代后形態(tài)無明顯改變（圖1）。

2.2 細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后，明視野可見細(xì)胞呈現(xiàn)三角形或長梭形生長，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞形態(tài)典型，細(xì)胞間存在明顯的接觸抑制。暗視野下，NC組無明顯熒光染色痕跡；PC組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均可見亮紅色熒光，核區(qū)更亮；F8組核區(qū)可見亮紅色熒光；CD組著色較淺，核區(qū)相對較強(qiáng)。據(jù)此，VWF和CD31兩個特異性的血管標(biāo)記物檢測陽性，陽性細(xì)胞比例超過90%，成功獲得原代SUVECs。

圖1 原代SUVECs的培養(yǎng)和顯微鏡觀察。A:第1代細(xì)胞 (×40);B:第2代細(xì)胞 (×100);C:第4代細(xì)胞(×200);D:第 6代細(xì)胞(×200)。

2.3 細(xì)胞活力和生長曲線

圖2 原代SUVECs活力和生長曲線

ICELLigence實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀對細(xì)胞生長曲線變化的監(jiān)測，結(jié)果顯示：以2.5×104個/mL的細(xì)胞濃度接種于E-Plate L8孔中的懸浮細(xì)胞4～6h完全貼壁，在經(jīng)過20h左右的平穩(wěn)潛伏期后緩慢進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在對數(shù)生長初期的24h中，細(xì)胞分裂速度較慢，增殖平緩，隨后細(xì)胞數(shù)迅速增加。在82h左右，細(xì)胞達(dá)到飽和密度，停止生長，進(jìn)入平頂期，之后逐漸退化衰亡（圖2）。對細(xì)胞損傷小，所得細(xì)胞活力高，消化時間和溫度可控范圍變大，更適用；臍帶37℃條件下分別灌注消化 5min、10min、15min，發(fā)現(xiàn)消化 10min 所得的細(xì)胞較多，細(xì)胞活性好，貼壁能力強(qiáng)，增殖快；消化5min，細(xì)胞消化不完全，所得細(xì)胞少；消化15min，細(xì)胞懸液中混有大量雜細(xì)胞和結(jié)締組織，培養(yǎng)后細(xì)胞大量死亡，活力差。同時發(fā)現(xiàn)在消化時間相同的條件下，使用37℃PBS緩沖液水浴較37℃恒溫培養(yǎng)箱效果更佳，有利于搖晃，使膠原酶和血管內(nèi)皮充分接觸，溫度均勻，消化快速完全，雜細(xì)胞少，不易污染。

培養(yǎng)條件影響SUVECs的生長狀況和活力[8]，探索發(fā)現(xiàn)36～38℃下，SUVECs都能正常生長，但隨著溫度的升高，生長速度增快，但對數(shù)生長期時間變短；培養(yǎng)箱氧分壓降低會導(dǎo)致SUVECs提前進(jìn)入平臺期；培養(yǎng)基的最適pH值是7.0～7.2，培養(yǎng)液pH值的改變會導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難，貼壁細(xì)胞失活脫落。本研究在傳代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，第1代生長的時間將近10d，而第2代生長的時間為7d，代數(shù)增加生長速度越快，但第5代以后生長時間穩(wěn)定在2～3d，因此選擇5代以前采取1:2傳代，5代以后采取1:3傳代。

VWF、CD31、CD34等是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性蛋白，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定的關(guān)鍵指標(biāo)[9-10]。實(shí)驗分離獲得的SUVECs采用免疫熒光鑒定，VWF和CD31兩種因子檢測均呈陽性超過90%，表明獲得了較高純度的SUVECs。通過多次探索，采用1%的I型膠原酶灌注消化法，分離得到了較高純度的SUVECs，活力較強(qiáng)，能夠傳代超過15代，為建立穩(wěn)定的SUVECs系提供了可靠材料，是研究豬胎盤血管發(fā)生及其對母豬生產(chǎn)性能影響的可靠細(xì)胞模型。

3 分析和討論

研究采用酶灌注消化法，操作簡單，容易實(shí)現(xiàn)無菌，得到的細(xì)胞量大且純度較高。同時發(fā)現(xiàn)在灌注消化酶液前，徹底的清洗臍帶，完全分離臍靜脈，保持臍靜脈管壁的完整性非常重要。探索中還發(fā)現(xiàn)使用胰酶消化可以獲得高純度的SUVECs，但細(xì)胞活力差，一般培養(yǎng)少于3代；I型膠原酶相對溫和，

[1]Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria [J].JClin Invest.1973,52(11)：2745-2756.

[2]張臣,李彤,侯躍龍,等.人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的高效分離與培養(yǎng)[J].天津醫(yī)藥.2010,38(7)：605-607.

[3]Hong HX,Zhang YM,etal.Immortalization of swine umbilical vein endothelial cells with human telomerase reverse transcriptase[J].Mol Cells.2007,24(3)：358-363.

[4]胡泉,柴家科,劉玲英,等.犬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 [J].Chinese Journal of Reparative and Recon－structive Surgery.2013,27(4)：460-463.

[5]Kadam SS,Tiwari S,Bhonde RR.Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord [J].In Vitro Cell Dev Biol Anim.2009,45(1-2)：23-27.

[6]Siow RC.Culture of human endothelial cells from umbilical veins[J].Methods Mol Biol.2012,806：265-274.

[7]Putman DM,Hess DA.Isolation of human umbilical cord blood aldehyde dehydrogenase-expressing progenitor cells that modulate vascular regenerative functions in vitro and in vivo[M].Curr Protoc Stem Cell Biol.2013,Chapter 2：Unit 2A.10.

[8]Baudin B,Bruneel A,Bosselut N,etal.A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells[J].Nat Protoc.2007,2(3)：481-485.

[9]Sun Z,Su H,Long B,etal.Endothelial cell high-enrichment from endovascular biopsy sample by laser capturemicrodissection and fluorescence activated cell sorting [J].JBiotechnol.2014,192：34-39.

[10]Winiarski BK,Acheson N,Gutowski NJ,etal.An improved and reliable method for isolation of microvascular endothelial cells from human omentum [J].Microcirculation.2011,18(8)：635-645.