哺乳仔豬流行滲出性皮炎的實(shí)驗(yàn)室診斷與防治分析

劉秋菊，李潤成，李蕓芳，黎滿香（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

豬滲出性皮炎主要由豬葡萄球菌引起[1]。豬葡萄球菌為革蘭氏陽性、條件性致病菌，常寄居于皮膚、黏膜上，可從健康豬鼻黏膜、結(jié)膜、耳朵或鼻、口部皮膚以及在小母豬和母豬的生殖道內(nèi)分離到該菌，當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化時或引起免疫抑制的因素存在時（如轉(zhuǎn)群、斷奶、混群飼料突然改變或通風(fēng)不良、免疫抑制性疾?。?，會導(dǎo)致該病的發(fā)生[2]。此外，免疫力在個體和群體發(fā)病過程中都有重要意義，其中母豬是否有免疫力對哺乳仔豬的感染具有重要的影響。松鼠葡萄球菌屬于凝固酶陰性的葡萄球菌，同樣廣泛存在于自然界中，同時也是危害人類重要的病原之一，主要引起人類的心內(nèi)膜炎、腹膜炎、敗血癥、尿道感染、以及手術(shù)中的傷口感染等[3]，近年來也有松鼠葡萄球菌引起小豬滲出性皮炎的報(bào)道[4]。

2014年4 月，本文就湖南懷化某新建規(guī)模豬場10日齡左右的哺乳仔豬陸續(xù)出現(xiàn)全身皮膚油脂樣滲出，用頭孢噻呋鈉、磺胺類、恩諾沙星等藥物治療效果不理想，發(fā)病嚴(yán)重小豬出現(xiàn)死亡的情況進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，結(jié)果從2頭發(fā)病豬的體表皮膚以及發(fā)病嚴(yán)重豬只的腹股溝淋巴結(jié)，分離到了2種不同菌落顏色的葡萄球菌，分別進(jìn)行藥物敏感性檢測，指導(dǎo)豬場針對性使用藥物。結(jié)果有效的控制了病癥的擴(kuò)散，治愈了大部分已發(fā)病的小豬，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

巧克力瓊脂培養(yǎng)基、鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自江門市某貿(mào)易有限公司，DNA聚合酶、DNTP購自北京某生化科技有限公司。

1.2 發(fā)病豬的臨床觀察與解剖

將送檢病豬放于解剖室，觀察其外部特征及行為表現(xiàn)后按常規(guī)方法處死并進(jìn)行解剖觀察、采樣。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢

從采集的病豬病變皮膚、淋巴結(jié)、腎臟無菌取樣，劃線接種于巧克力平板后，放于37℃培養(yǎng)12h后，從形態(tài)一致且數(shù)量較多的菌群中挑取有代表性的單個菌落劃線接種鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待菌落長出后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分離菌16SrRNA基因的擴(kuò)增與測序、Blast分析

參照文獻(xiàn)[5]合成細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物，然后以分離的細(xì)菌為模板進(jìn)行16SrRNA PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增方法按常規(guī)進(jìn)行。將PCR產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序，并將測出序列于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析確定分離菌為何種細(xì)菌，最后將測出序列與GenBank登錄的相同細(xì)菌序列用DNASTAR生物軟件進(jìn)行同源性比對，衡量測出序列與已登錄序列的同源性。

1.5 分離的藥物敏感性檢測及臨床治療試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)的單個菌落，于TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)后調(diào)整菌液濃度值至0.5個麥?zhǔn)蠁挝粷舛群蟛捎眉埰ㄟM(jìn)行藥物敏感性檢測。選出敏感藥物后，采用相應(yīng)藥物對發(fā)病豬進(jìn)行治療，觀察藥物效果。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病豬臨床及解剖觀察結(jié)果

從送檢的2頭病豬可見，1頭發(fā)病嚴(yán)重的小豬全身油脂樣滲出、形成皮痂并有脫落現(xiàn)象，另1頭發(fā)病早期的小豬主要表現(xiàn)在耳朵部位有油脂樣滲出（見圖1）。2頭小豬解剖情況為，發(fā)病早期的小豬實(shí)質(zhì)臟器物明顯病變，且發(fā)病嚴(yán)重的小豬可見淋巴結(jié)邊緣出血、腎臟有出血點(diǎn)。

圖1 發(fā)病小豬外貌特征

圖2 乳白色細(xì)菌

圖3 淡黃色細(xì)菌

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

從采集的2頭小豬皮膚樣本以及淋巴結(jié)取樣進(jìn)行細(xì)菌分離。結(jié)果1頭發(fā)病早期的小豬只從皮膚樣本中分離到大量細(xì)菌，其中數(shù)量最多的細(xì)菌為乳白色較大的菌落，從發(fā)病嚴(yán)重的小豬除從皮膚樣本分離到大量乳白色菌落外，從淋巴結(jié)分離到了2種數(shù)量較多的細(xì)菌，1種為乳白色較大菌落，1種為淡黃色較大菌落。挑取代表性的乳白色菌落以及黃色菌落分別于鮮血瓊脂進(jìn)行純培養(yǎng)，結(jié)果見圖2、圖3。從純培養(yǎng)的細(xì)菌挑菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，2種顏色菌落的細(xì)菌在顯微鏡下均為陽性球菌。

2.3 細(xì)菌16SRRNA基因擴(kuò)增以及測序分析結(jié)果

挑取純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并于PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。將測出序列進(jìn)行Blast分析發(fā)現(xiàn)此次分離到的2種不同菌落顏色的細(xì)菌均為葡萄球菌。使用DNASTAR分析軟件中的MegAlign程序，運(yùn)用ClustalW方法對所測序列與GenBank登錄序列進(jìn)行比較，并繪制序列同源性距離圖（如圖4。2CL、5WD：測出序列，KJ783382、NR_036905：豬葡萄球菌，Staphylococcus sciuri KJ507203、 Staphylococcus sciuri KM276789：松鼠葡萄球菌，Staphylococcus chromogenes KJ783393：產(chǎn)色葡萄球菌）。結(jié)果表明，乳白色菌落細(xì)菌16S rRNA與豬葡萄球菌同源性為99.2%，黃色菌落形態(tài)的細(xì)菌16S rRNA與松鼠葡萄球菌同源性為99.4%。

圖4 測出序列與GenBank登錄序列同源性比較圖

2.4 分離菌藥物敏感性檢測結(jié)果

挑取純培養(yǎng)的單個菌落，于TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)后，采用紙片法進(jìn)行藥敏檢測。結(jié)果見表1。由表1可見從送檢豬分離到的2種葡萄球菌菌對頭孢噻吩、先鋒V號均比較敏感，對阿奇霉素、慶大霉素、紅霉素、鏈霉素、氨芐西林、青霉素、復(fù)方新諾明、磺胺甲基磺胺甲基異惡唑均不敏感，對恩諾沙星、林可霉素、新霉素、頭孢他啶、氟苯尼考、阿莫西林的敏感性存在差異。建議豬場選用頭孢噻吩或頭孢拉啶給發(fā)病豬肌肉注射，每天兩次，連用3天，同時輔以每天體表高錳酸鉀水清洗1次，嚴(yán)重豬只肌注1～2次地塞米松、每天1次。結(jié)果治療了13頭小豬，使10頭豬得到了盡快康復(fù)，3頭豬由于過于嚴(yán)重，未能治愈。

表1 白色菌落葡萄球菌和黃色菌落葡萄球菌藥物敏感性檢測結(jié)果

3 討論與分析

3.1 發(fā)病原因分析

本文就哺乳仔豬發(fā)生滲出性皮炎這一情況，從2頭發(fā)病小豬皮膚組織以及淋巴結(jié)進(jìn)行了細(xì)菌分離，結(jié)果分離到2種數(shù)量較多的優(yōu)勢菌。通過PCR方法擴(kuò)增出分離菌的16SrRNA基因，進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)兩種不同菌落顏色的細(xì)菌分別與豬葡萄球菌以及松鼠葡萄球菌相應(yīng)基因同源性達(dá)到99.2%和99.4%。因此，可以肯定本文從發(fā)病豬分離到的優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌，至于是否是豬葡萄球菌和松鼠葡萄球菌尚需進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。此外，本文用分離的葡萄球菌分別進(jìn)行了藥物敏感性檢測，選用兩種細(xì)菌均敏感的藥物藥物成功治愈了發(fā)病小豬，并通過加強(qiáng)欄舍衛(wèi)生消毒、以及接產(chǎn)、剪牙、斷尾、斷臍的消毒工作逐步控制了滲出性皮炎的流行，可見該哺乳仔豬滲出性皮炎為葡萄球菌感染所致。

葡萄球菌常做為條件性致病菌出現(xiàn)，寄居于動物皮膚、黏膜上，可從健康豬鼻黏膜、結(jié)膜、耳朵或鼻、口部皮膚以及在小母豬和母豬的生殖道內(nèi)分離到該菌，只有當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化時或引起免疫抑制的因素（轉(zhuǎn)群、斷奶、混群飼料突然改變或通風(fēng)不良、免疫抑制性疾病）存在時，才會導(dǎo)致該病的發(fā)生。該豬場哺乳仔豬發(fā)生葡萄球菌的感染引起滲出性皮炎，并呈流行趨勢，除與豬場飼養(yǎng)管理衛(wèi)生狀況不理想有關(guān)外，主要可能是由于該豬場為新建豬場，所有哺乳仔豬均來自第一胎產(chǎn)仔母豬，從母豬獲得的抵抗葡萄球菌感染的母源抗體相對較低存在一定的關(guān)系。

3.2 防治建議

哺乳仔豬滲出性皮炎，主要由葡萄球菌引起。葡萄球菌為革蘭氏陽性、條件致病菌，常寄居于皮膚、黏膜上，當(dāng)動物機(jī)體的抵抗力降低或皮膚、黏膜破損時，病菌便乘虛而入，因此，筆者建議，在發(fā)生有滲出性皮炎的豬場，應(yīng)該從搞好飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生消毒工作入手，結(jié)合小豬傷口消毒管理，特別是初生小豬的剪牙、斷臍帶、斷尾、疫苗注射等的消毒工作來防控葡萄球菌的感染。發(fā)病嚴(yán)重的豬場，特別是第一胎產(chǎn)仔母豬較多的豬場，可以考慮分離病原菌制備疫苗接種初產(chǎn)母豬來提高哺乳仔豬對葡萄球菌的抵抗能力。至于發(fā)病豬群，可選用對陽性菌具有較強(qiáng)殺滅能力的第2代頭孢類藥物、結(jié)合外用消毒藥物來進(jìn)行治療。由于葡萄球菌常有較強(qiáng)的耐藥性，豬場在選用抗生素治療葡萄球菌感染時最好進(jìn)行藥物敏感性檢測來針對性選藥，以便達(dá)到用藥效果好而又副作用小、成本低廉的目的。

[1]劉忠行,宋金成,王 騰,等.仔豬滲出性皮炎的病原分離鑒定與防控[J].中國獸醫(yī)雜志,2013,(7)：43-45.

[2]張 曦.豬滲出性皮炎病原的分離鑒定及間接ELISA檢測方法的研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[3]何木榮,王科文,農(nóng)華杰,等.仔豬滲出性皮炎的病原和致病機(jī)理研究進(jìn)展及防制措施[J].養(yǎng)豬,2012,（1）：81-83.

[4]齊 靜,孫守禮,杜以軍,等.哺乳仔豬滲出性皮炎的病原學(xué)診斷及綜合防治[J].畜牧與獸醫(yī),2009,(9)：84-88.

[5]Run Cheng Li,Chao Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis in Masked Palm Civet(Paguma larvata)[J].2012,11(12)：2020-2023.