DNA條形碼技術(shù)在部分菱屬植物分子鑒定中的應(yīng)用

董晶萊，高廣春，黃 嬛，李 白，李 軍*

（1.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001；2.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016）

DNA條形碼技術(shù)在部分菱屬植物分子鑒定中的應(yīng)用

董晶萊1，高廣春1，黃 嬛1，李 白2，李 軍2*

（1.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001；2.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016）

為了彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足，本研究利用DNA條形碼技術(shù)，選取標(biāo)準(zhǔn)基因序列對(duì)部分菱屬植物進(jìn)行初步的分子鑒定。通過(guò)對(duì)浙江、江蘇2省南湖菱、兩角菱、四角菱的ITS，matK和rbcL序列擴(kuò)增及多重序列比對(duì)，探尋菱屬植物的分子鑒定方法?？寺×肆鈱僦参?92 bp的ITS序列、878 bp的matK序列及685 bp的rbcL序列，其中matK和rbcL序列不存在變異位點(diǎn)，不能用于鑒定菱屬植物；ITS序列存在20個(gè)變異位點(diǎn)，包括6處插入/缺失和14處堿基置換，在部分菱屬植物的分子鑒定中具有應(yīng)用價(jià)值。

菱屬；分子鑒定；DNA條形碼

菱科（Trapaceae）菱屬（Trapa L.）植物為一年生水生草本植物，在中國(guó)南方尤其以長(zhǎng)江下游太湖地區(qū)和珠江三角洲栽培最多。菱果肉含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸及多種維生素和微量元素，菱殼具有抗食道癌、乳腺癌、子宮頸癌等藥用價(jià)值。菱屬植物包含多個(gè)栽培種和野生種，栽培種包括南湖菱（Trapa acornis Nakano）、四角菱（Trapa quadrispinosa Roxb）、二角菱 （Trapa bispinosa Roxb.）及烏菱（Trapa bicornis Osbeck）等；野生種包括野菱（Trapa incise var.Sieb.）、耳菱（Trapa potanini V.Vassil.）、冠菱（Trapa litwinowii V.Vassil.）、格菱（Trapa pseudoincisa Nakai.）及細(xì)果野菱（Trapa maχimowiczii Korsh）等［1-2］。菱屬植物的分類學(xué)研究多集中在常規(guī)的形態(tài)分類學(xué)、數(shù)量分類學(xué)、細(xì)胞分類學(xué)以及花粉形態(tài)學(xué)等方面［3-8］，不同分類方法對(duì)菱屬植物的聚類分析存在一定差異。由于菱屬植株的形態(tài)及果肉等營(yíng)養(yǎng)形態(tài)基本相同，傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)方法在菱屬植物的鑒別上有局限性。近年來(lái)已有應(yīng)用分子生物學(xué)方法研究菱屬植物親緣關(guān)系及分子鑒別的研究報(bào)道［1-2，9-12］，大多是利用 DNA指紋標(biāo)記對(duì)菱屬植物進(jìn)行分類及系統(tǒng)進(jìn)化研究。鑒于菱在農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的重要作用，及其種質(zhì)混亂、鑒別方法不統(tǒng)一的現(xiàn)狀，對(duì)單一品種菱建立一套可靠的分子鑒定方法勢(shì)在必行。

DNA條形碼技術(shù)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，基于物種內(nèi)的特異性和物種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定［13］，該技術(shù)已被成功應(yīng)用于生物物種的分類和鑒定等領(lǐng)域［2，14-16］。常用的 DNA序列有 matK，trnH-psbA，rbcL和ITS等，通過(guò)單一片段或多片段組合的方式構(gòu)建不同植物的 DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)［17］。

matK基因位于 trnK基因的內(nèi)含子中，約1 500 bp，編碼一種成熟酶（matuease）。matK序列的變異較均一，變異中轉(zhuǎn)換和顛換以及密碼子3個(gè)位置的變異頻率沒(méi)有嚴(yán)重的偏離，增強(qiáng)了分子系統(tǒng)樹(shù)的可靠性［15］。rbcL基因編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶的大亞基，rbcL序列的變異主要存在于種以上水平，物種水平上通常變異不大，其變異位點(diǎn)較均勻地分布于整個(gè)基因上［17］。核糖體DNA ITS（18S-5.8S-26S）片段廣泛分布于真核生物和真菌中，是系統(tǒng)學(xué)研究中最常用的片段之一，常用作種水平區(qū)分的片段［2］。因此，本研究以浙江省和江蘇省的栽培種南湖菱、四角菱及二角菱為研究材料，選取matK，rbcL和ITS序列對(duì)菱屬植物進(jìn)行分子鑒定，為菱屬植物的鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)所用材料包括浙江嘉興的南湖菱 （T. acornis Nakano），果皮綠白色，試驗(yàn)編號(hào)為T1-1；浙江溫州和江蘇南京的二角菱（T.bispinosa Roxb），果皮暗紫色，試驗(yàn)編號(hào)為T2-1和 T2-2；浙江嘉興和江蘇南京的四角菱（T.quadrispinosa Roxb），果皮分別為水紅色和綠色，試驗(yàn)編號(hào)分別為T3-1和T3-2。菱角種類的鑒定參照中國(guó)菱屬植物分類方法［18-19］。

DNA聚合酶和dNTPs等購(gòu)于寶生物工程 （大連）有限公司，引物和PCR產(chǎn)物測(cè)序委托英濰捷基 （上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 總DNA提取和PCR擴(kuò)增

總DNA提取方法：用清水洗凈菱角果實(shí)，解剖刀快速取出菱胚，每個(gè)測(cè)試樣品分別取5個(gè)菱胚進(jìn)行混合，用 CTAB法提取總DNA［20］，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

用于PCR反應(yīng)的ITS，matK和rbcL序列引物分別：ITS-F為5＇-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3＇，ITS-R為5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；matK-F為5＇-CGATCTATTCATTCAATATTTC-3＇，matK-R為5＇-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3＇；rbcL-F為5＇-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3＇，rbcL-R為5＇-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3＇。

克隆ITS序列的PCR反應(yīng)體系為20μL，2× GC buffer I 10μL、dNTPs（2.5 mmol·m L-1）0.5μL、上下游引物 （10μmol·m L-1）各0.5μL、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、ddH2O 7.3μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 m in，共36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 m in，4℃保存。matK和rbcL序列的PCR反應(yīng)體系為20μL，10× PCR buffer 2μL、dNTPs（2.5 mmol·m L-1）0.5μL、上下游引物（10μmol·m L-1）各0.5μL、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、ddH2O 15.3μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后割膠回收目的條帶，送英濰捷基 （上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行回收、純化及測(cè)序。

1.3 序列分析及多重比對(duì)

分別將ITS、matK和rbcL序列在NCBI進(jìn)行Blast分析，用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列擴(kuò)增及比對(duì)

通過(guò)PCR擴(kuò)增，5個(gè)測(cè)試樣品均獲得了692 bp的ITS序列 （圖1），序列分析表明ITS序列包含262 bp的ITS1序列、166 bp的5.8S rDNA序列及264 bp的ITS2序列。序列比對(duì)表明，5個(gè)測(cè)試樣品的ITS序列相似度達(dá)95%以上，（G+C）含量偏高。南湖菱ITS序列 （G+C）含量為58.96%，（A+T）含量為41.04%。

圖1 菱屬植物ITS序列引物PCR結(jié)果

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得9個(gè)菱屬植物的ITS序列：江蘇蘇州四角菱 （AY315464）、江蘇泰州四角菱 （AY315466）、江蘇南通二角菱（AY315465）、安徽蕪湖二角菱 （AY315468）、江蘇南通烏菱 （AY315463）、安徽蕪湖烏菱（AY315470）、江蘇南京野菱 （AY315462）、湖北梁子湖細(xì)果野菱 （AY035757）及歐菱 （FM887019）的ITS序列。多重序列比對(duì)表明，ITS序列存在20個(gè)變異位點(diǎn) （圖2），其中6處插入/缺失和10處堿基置換位于ITS1序列，4處堿基置換位于ITS2序列，5.8S rDNA序列中不存在變異位點(diǎn)。6處插入/缺失分別位于第17，18，71，107，130和207 bp處；14處堿基置換分別為12 bp（A?G），15 bp（A?G），36 bp（A?G），63 bp（C?T），482 bp（T?C），508 bp（A?G），606 bp（A?G）的轉(zhuǎn)換和9 bp（T?G）、10 bp（C?G）、11 bp（A?C）、67 bp（T?G）、134 bp（C?G）、201 bp（T?G）、448 bp（T?G）的顛換。本試驗(yàn)的5個(gè)測(cè)試樣品僅在第36 bp及67 bp處有差異 （圖2），浙江溫州二角菱在第36 bp為 “G”，其余4種菱均為 “A”；浙江溫州二角菱和浙江嘉興四角紅菱在第67 bp為 “G”，其余3種菱角為 “T”。

圖2 不同種菱屬植物的ITS序列比對(duì)

2.2 matK基因擴(kuò)增及序列比對(duì)PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果表明，5個(gè)測(cè)試樣品都獲得了878 bp的matK序列 （圖3），樣品間序列相似度為100%。統(tǒng)計(jì)分析表明，菱屬植物的matK序列 （G+C）含量偏低，為32.80%， （A+T）含量為67.20%。GeneBank中尚未有菱屬植物的matK基因登錄，通過(guò)Blast檢索到海?？啤⑶丝频瓤茖僦参锏膍atK基因序列與本試驗(yàn)克隆的matK序列相似度達(dá)95%以上。用MEGA 4.1軟件構(gòu)建matK序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，在matK序列涉及到的植物中，菱屬植物與海?？浦参镉H緣關(guān)系最近，與千屈菜科植物次之，與桃金娘科植物親緣關(guān)系最遠(yuǎn) （圖4）。

圖3 菱屬植物matK及rbcL序列PCR結(jié)果

圖4 菱屬植物與其他物種的matK序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 rbcL基因擴(kuò)增及序列比對(duì)

5個(gè)測(cè)試樣品都獲得了685 bp的rbcL序列片段 （圖3），樣品間序列相似度為100%，（G+C）含量為41.17%，（A+T）含量為58.83%。將克隆的rbcL序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中歐菱和細(xì)果野菱的序列進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn) （圖5），rbcL序列存在5個(gè)變異位點(diǎn)，包括1處插入/缺失和4處堿基置換，1處插入/缺失位于10 bp處，4處堿基置換包括第109 bp和110 bp處的2處堿基顛換，4 bp和111 bp處的2處堿基轉(zhuǎn)換。

圖5 菱角與歐菱和細(xì)果野菱的rbcL序列比對(duì)

3 小結(jié)和討論

自加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert［21］于2003年首次提出DNA條形碼的概念以來(lái)，該研究已成為生物分類學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。該技術(shù)利用基因組中一段通用的標(biāo)準(zhǔn)短序列進(jìn)行物種鑒定，現(xiàn)已提出10多條植物候選DNA條形碼序列，其中以ITS，matK，rbcL及trnH-psbA的單一片段或幾個(gè)片段的組合應(yīng)用較多［22］。 現(xiàn)已在胡椒屬［16］、 錦葵科［15］、忍冬科［23］、 石斛屬［24］、 重樓屬［14］等植物的系統(tǒng)進(jìn)化及分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)也在藥用植物藏藥雪蓮［25］、 女貞子［26］、 杜仲［27］等基原植物的分子鑒定中得到應(yīng)用。

本研究以南湖菱、二角菱和四角菱為研究材料，克隆ITS、matK及rbcL序列，通過(guò)多重序列比對(duì)，找尋菱屬植物序列變異位點(diǎn)。在測(cè)試的3個(gè)DNA條形碼序列中，ITS序列變異位點(diǎn)較多，有20個(gè)，均位于ITS1和ITS2序列，包括6處插入/缺失和14處堿基置換，5.8S rDNA序列中不存在變異位點(diǎn)，這與保曙琳等［2］的研究報(bào)道一致。由于rDNA比cpDNA具有更快的進(jìn)化速率，而且不存在cpDNA的母系單向遺傳問(wèn)題，所以rDNA ITS序列是近年來(lái)用于探討植物種內(nèi)變異和種間、近緣屬間分子系統(tǒng)關(guān)系的重要分子標(biāo)記之一，已被廣泛應(yīng)用于胡椒屬、錦葵科、石斛屬及重樓屬等科屬植物的分子鑒定研究中［2］。據(jù)保曙琳等［2］的研究報(bào)道，南湖菱與二角菱在ITS序列中的鑒別位點(diǎn)在508號(hào)堿基上，南湖菱為 “G”，二角菱為 “A”。本研究結(jié)果表明，在第508號(hào)堿基上，除來(lái)源于江蘇南通的二角菱 （GenBank登錄號(hào)AY315465）為“A”外，包括南湖菱在內(nèi)的其余菱均為 “G”，因此，ITS序列第508號(hào)堿基是否能作為鑒別南湖菱與二角菱的位點(diǎn)還有待進(jìn)一步擴(kuò)大采樣地點(diǎn)及樣本數(shù)量來(lái)分析。測(cè)試樣品中matK和rbcL序列不存在變異位點(diǎn)，不能用來(lái)鑒定菱屬植物。

本試驗(yàn)的5個(gè)研究材料涉及南湖菱、四角菱及二角菱3個(gè)種，均為栽培種，各種之間的差異為種內(nèi)差異。ITS序列變異位點(diǎn)分析表明，3個(gè)種之間具有較高的遺傳穩(wěn)定性，ITS序列在菱屬植物種內(nèi)分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：侯春曉）

S567.21+9

A

0528-9017（2015）04-0530-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20150427

2014-11-24

嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2013AY21047）；十二五浙江省高校重點(diǎn)學(xué)科 （藥理學(xué)）；2011年嘉興市重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)——天然藥物與健康食品研發(fā)技術(shù)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （201410354021）

董晶萊（1992-），女，本科生。E-mail：gaogcjx@163.com。

李 軍。E-mail：lijun jx1@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式：董晶萊，高廣春，黃嬛，等.DNA條形碼技術(shù)在部分菱屬植物分子鑒定中的應(yīng)用 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（4）：530-533，557.