環(huán)境水體中病原微生物與指示微生物的相關(guān)性研究

陳勝藍，尹紅果，陳夢清，陳 松，鄭圓圓，Randy A Dehlgren，2，3，張明華，2，3，商 栩*

（1.溫州醫(yī)科大學 水環(huán)境應(yīng)用技術(shù)研究所，浙江 溫州 325035；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院 護理學院，湖南 衡陽 421005；3.美國加州大學戴維斯分校 土壤、大氣與水資源系，加州 戴維斯 95616）

環(huán)境水體中病原微生物與指示微生物的相關(guān)性研究

陳勝藍1，尹紅果1，陳夢清1，陳 松1，鄭圓圓1，Randy A Dehlgren1，2，3，張明華1，2，3，商 栩1*

（1.溫州醫(yī)科大學 水環(huán)境應(yīng)用技術(shù)研究所，浙江 溫州 325035；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院 護理學院，湖南 衡陽 421005；3.美國加州大學戴維斯分校 土壤、大氣與水資源系，加州 戴維斯 95616）

對夏、冬兩季溫瑞塘河水體中病原微生物與常用指示微生物糞大腸桿菌和大腸埃希菌的關(guān)系進行了研究，針對水環(huán)境中傷寒沙門氏菌建立了環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的快速檢測方法。結(jié)果顯示，溫瑞塘河水體中微生物污染較嚴重，糞大腸菌群數(shù)量高達1.10×103～1.40×107mL-1，超過60%的站位微生物污染程度超過地表水V類水質(zhì)標準。大腸埃希菌濃度為1.00×104～5.08×106m L-1，且這2種常用的指示微生物間表現(xiàn)出較高的相關(guān)性。不同污染程度的水體中傷寒沙門氏菌的檢出率差異顯著，且夏季的檢出率要高于冬季。在糞大腸桿菌濃度低于104m L-1的水樣中，未能檢出傷寒沙門氏菌；但水樣中糞大腸桿菌濃度高于104m L-1時，傷寒沙門氏菌的檢出率隨糞大腸桿菌濃度上升而上升；當水體中糞大腸桿菌濃度超過106m L-1時，傷寒沙門氏菌的檢出率達100%。本研究結(jié)果表明，常用的水環(huán)境指示微生物能夠在一定程度上反映水體病原微生物的污染情況，但在具體應(yīng)用中需考慮到污染源及水體理化條件等差異。

環(huán)境水體；病原微生物；指示微生物；相關(guān)性

近年來，新發(fā)、突發(fā)的重大傳染病對人民生命健康和經(jīng)濟社會發(fā)展帶來的嚴重威脅，特別是2003年SARS、2005年禽流感、2009年 H1N1流感等突發(fā)傳染病疫情的發(fā)生，給全人類敲響了警鐘，世界各國都開始從不同角度重新審視各種潛在的環(huán)境安全問題。世界衛(wèi)生組織 （WHO）指出傳染性疾病的出現(xiàn)和再現(xiàn)現(xiàn)象中，約有75%的新型病原體來自于人畜共患?。?］，而疾病的重要傳播媒介地表水又極易受到人類和動物活動的污染［2］。據(jù)報道，發(fā)展中國家各種傳染病中有90%與水污染有關(guān)，全球每年大約有300萬至400萬人，其中包括200多萬兒童，直接死于因飲用不潔凈的水而引起的疾病。目前，水媒傳播引起的疾病仍是我國急性傳染病中發(fā)病數(shù)最多，流行面最廣的一類疾病，水體病原微生物污染問題的研究與解決迫在眉睫。

由于水中致病微生物生物量少且檢測難度大，因此往往通過檢測指示微生物來評估水體病原菌的污染狀況［3-4］。指示微生物法可靠與否取決于其是否真實反映了致病微生物在水體中的分布情況，但目前對二者在環(huán)境水體中的關(guān)聯(lián)性研究還較少，運用指示微生物法進行致病微生物風險評估存在許多不確定性。沙門氏菌在環(huán)境中普遍存在，可通過人類、畜、禽的糞便或帶菌者直接或間接地污染水體，引起結(jié)腸炎、痢疾、心內(nèi)膜炎、心包炎、腦膜炎等疾病，是重要的病原微生物檢測指標。但鑒于當前國內(nèi)外關(guān)于沙門氏菌檢測方法如培養(yǎng)法、免疫學方法、分子生物學方法等普遍存在檢測費時費力，價格昂貴及靈敏度不穩(wěn)定等諸多不利因素［5-8］，本文選擇了最新的分子生物學快速檢測方法環(huán)介導等溫擴增技術(shù)對沙門氏菌進行檢測分析，再結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測環(huán)境水體常用指示微生物糞大腸桿菌和大腸埃希菌的含量，以期獲得指示微生物和致病菌在江南典型城市平原河網(wǎng)水體中的時空分布規(guī)律，并進一步探討二者在水環(huán)境中被檢出結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性，為水體潛在的疾病風險預測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

溫瑞塘河位于中國浙江省溫州市甌江以南、飛云江以北的溫瑞平原，水源主要來自瞿溪、熊溪、郭溪三大源頭，水域面積22 km2，流域面積740 km2，灌溉面積321.3 km2，水系河網(wǎng)總長度1 178.4 km，多年平均降雨量1 694.8 mm，被當?shù)厝朔Q為 “母親河”。

本研究以整個溫瑞塘河為研究區(qū)域，在國家標準 《采樣方案設(shè)計技術(shù)》的基礎(chǔ)上結(jié)合溫瑞塘河的河網(wǎng)、地形地貌特征，于不同季節(jié)、特殊水文事件 （如臺風）或水源性傳染病高發(fā)時期，并且結(jié)合近幾年冬夏季節(jié)對溫瑞塘河40個常規(guī)檢測點的傳統(tǒng)培養(yǎng)大腸桿菌的檢測結(jié)果，在溫瑞塘河各主要類型河道中的常規(guī)監(jiān)測站位、特定場所 （醫(yī)院、養(yǎng)殖場）周邊河道等設(shè)置5個站位采集水樣 （圖1），同時測定、記錄水體基本理化參數(shù)，如表1所示。

圖1 溫瑞塘河流域河水微生物采樣點分布圖

表1 溫瑞塘河各監(jiān)測點的水質(zhì)指標

1.2 沙門氏菌環(huán)介導等溫擴增 （LAMP）快速檢測方法

為研究水體沙門氏菌的分布情況，采集水樣后，分別把500 mL各個采樣點的水樣過濾于0.45μm的微孔濾膜，然后用水體DNA提取試劑盒提取水中微生物的DNA，得到的基因組樣品放入冰箱中備用。

選用傷寒沙門氏菌作為目標病原微生物，利用LAMP快速檢測方法對其進行檢測，擴增引物選擇傷寒沙門氏菌（S.typhimurium CMCC 50115）的特異基因phoP的保守序列，引物序列由上海生工生物工程公司合成，具體序列如下：上游內(nèi)部引物（Forward inner primer，F(xiàn)IP）5＇-GGCGTGAGAGATC CACCTGGAATGCGCCGTAATAGCGGTC-3＇，下游內(nèi)部引物（Backward inner primer，BIP）5＇-CACCA TTATGGAAACGCTTATCCGCCGGATACAGCTGAAG CATC-3＇；上游循環(huán)引物（Forward loop primer， LF）5＇-CAGGTGATCAACATCCCGCC-3＇，下游循環(huán)引物（Backward loop primer，LB）；上游外部引物（Forward outer，F(xiàn)3）5＇-GCCATTCCACATCGAAGAG GT-3＇，下游外部引物（Backward outer，B3）5＇-ATGAGAACATCAATGGTATGGC-3＇。

LAMP反應(yīng)體系為：F3與B3各5 pmol；BIP與FIP各40 pmol，其他反應(yīng)組分濃度分別為：1.4 mmol dNTP，0.8 mmol Betain，8 mmol MgSO4，20 mmol·L-1Tris-HCl（pH值8.8，25℃），10 mmol·L-1KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，0.1% TritonX-100，BstDNA polymerase lμL（8 U），模板DNA 2μL，ddH2O補足體積到25μL。反應(yīng)條件為63℃恒溫反應(yīng)1 h，80℃滅活10 m in。

1.3 水體指示微生物的測定

根據(jù)標準方法 （國家環(huán)保局 《水和廢水檢測分析方法》）進行水樣的采集、保存及分析，并對水質(zhì)細菌學指標糞大腸桿菌進行測定。糞大腸桿菌采用多管發(fā)酵技術(shù)，將不同水樣按污染程度不同稀釋3個接種量于適量乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中進行初發(fā)酵，（37±0.5）℃恒溫培養(yǎng) （24±2）h，然后挑取各個陽性管 （產(chǎn)酸產(chǎn)氣）中的菌體接種于EC培養(yǎng)液進行復發(fā)酵，（44±0.5）℃恒溫培養(yǎng) （24± 2）h，最后根據(jù)復發(fā)酵陽性管數(shù)量查詢MPN最大或然數(shù)表，報告結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2007作圖，利用SPSS v17.0統(tǒng)計學軟件對糞大腸桿菌檢出濃度值進行單樣本K-S正態(tài)分布假設(shè)檢驗，從而判斷分布規(guī)律。利用Spearman秩相關(guān)分析指示微生物和病原微生物是否具有顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 指示微生物的檢測結(jié)果及分布特點

大腸埃希菌和糞大腸桿菌檢測結(jié)果表明，糞大腸桿菌在各個采樣點均有分布，數(shù)量高達1.1× 103～1.4×107m L-1，根據(jù)GB 3838—2002《地表環(huán)境質(zhì)量標準》，超過60%的站位微生物污染程度超過地表水V類水質(zhì)標準。大腸埃希氏菌的存在也比較廣泛，除A3沒有測出以外，其他監(jiān)測點濃度值在1.0×104～5.08×106m L-1。根據(jù)濃度范圍可知，處于人口分布密集的生活區(qū)內(nèi)的C1站位和污染較輕的A3、W3站位，糞大腸桿菌濃度最大相差4個數(shù)量級，而大腸埃希氏菌濃度差也高達2個數(shù)量級 （圖2、圖3）。從季節(jié)變化情況看來，糞大腸菌群各個監(jiān)測點中糞大腸桿菌濃度隨季節(jié)變化而差異顯著。除C1以外，A3、B7、B15和W 3監(jiān)測站位的糞大腸桿菌濃度隨季節(jié)變化明顯，夏季均比冬季高 （圖2、圖3）。

圖2 大腸埃希菌和糞大腸桿菌數(shù)的分布情況

2.2 傷寒沙門氏菌的時空分布特點

圖3 糞大腸桿菌數(shù)量的季節(jié)分布

利用LAMP方法對傷寒沙門氏菌特異基因進行擴增、檢測，各采樣點傷寒沙門氏菌的陽性檢出率如圖4所示。由圖可以看出，傷寒沙門氏菌在各個監(jiān)測點所取的若干份水樣中都有檢測到，但陽性檢出率之間存在一定的差異。污染較為嚴重的B7和C1兩站位沙門氏菌的陽性檢出率較高，為60%，B15站位為40%，而A3和W 3相應(yīng)較低為20%。沙門氏菌季節(jié)分布特點如圖5所示，由圖可以看出，沙門氏菌陽性檢出率在夏季高出冬季，夏季的陽性檢出率為50%，而冬季為30%。

圖4 不同站位沙門菌檢測陽性率

圖5 夏季和冬季沙門菌檢測陽性率

2.3 病原微生物與指示微生物的關(guān)系

對糞大腸桿菌和大腸埃希菌進行皮爾森簡單相關(guān)分析，結(jié)果表明，大腸埃希菌與糞大腸菌群在0.05水平上有顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.904，此結(jié)果與宋志文等人對人工濕地的研究結(jié)果相似［9］。對大腸埃希菌和糞大腸桿菌進行回歸曲線估計，其線性關(guān)系結(jié)果如圖6所示。

圖6 糞大腸桿菌和大腸埃希菌的關(guān)系

為探討沙門氏菌和指示微生物的相關(guān)性，將所有樣品的沙門氏菌陽性檢出率根據(jù)糞大腸桿菌濃度進行分級，結(jié)果如圖7所示，由圖可以看出，在糞大腸桿菌濃度低于104m L-1的水樣中，未能檢出傷寒沙門氏菌；但糞大腸桿菌濃度高于104m L-1時，傷寒沙門氏菌的檢出率隨糞大腸桿菌濃度增大而上升；當水體中糞大腸桿菌濃度超過106m L-1時，傷寒沙門氏菌的檢出率達100%。

圖7 沙門菌陽性率和糞大腸桿菌濃度的關(guān)系

3 討論

環(huán)境水體中微生物的分布情況與各個站位所處的周邊環(huán)境和水質(zhì)狀況等因素密切相關(guān)。本研究所選取的站位中，B7位于閘門口，與存在污水直排情況的甌江相通，濁度較大；C1位于密集生活區(qū)內(nèi)，大量生活廢水、污水的外排，導致微生物大量滋生，水體污染相當嚴重，所以這2個站位水樣中病原菌的陽性檢出率也相應(yīng)升高。國外大量研究者針對不同河流的不同區(qū)域的水體沙門氏菌進行了檢測，結(jié)果表明，水域差異性導致檢測到的沙門氏菌陽性率存在較大波動。Rajabi M等在薩旺尼河地表水的多個站位針對沙門氏菌的invA基因進行了檢測，所有樣本有96%為陽性結(jié)果［10］；Anselmo R J等對阿根廷的盧漢河沙門氏菌屬進行了研究，收集的690份水樣中分離出了434個陽性樣本，陽性率達62.9%［11］。其他研究人員也分別對不同地區(qū)的水體沙門氏菌做了相應(yīng)研究，其陽性檢出率分別達到15.4%，8.5%，18.0%［12-14］。另外，相關(guān)研究結(jié)果表明水體沙門氏菌在不同時間、不同水生環(huán)境中的存在和豐度也有很大區(qū)別［15］，而且如果存在一種或多種不同的污水廢水 （農(nóng)業(yè)灌溉用水、被動植物排泄物污染的水等）一起排入河道，也會導致病原微生物檢測的不確定性［16］。再者，也可能與沙門氏菌自身在環(huán)境中的存活能力有關(guān)［17］，沙門氏菌有13種不同的血清型，在環(huán)境中存活持久性存在較大差異。

從季節(jié)分布差異看來，本研究的檢出情況是符合沙門氏菌本身的生物習性的，沙門氏菌能在10～42℃的環(huán)境下生長，最適宜生長的溫度是 35～37℃。處于東南沿海的溫州，夏季時間持續(xù)較長，氣溫高、雨水多，而沙門氏菌與溫度和降雨呈正相關(guān)［17］，所以檢出率較高。然而在溫度逐降，環(huán)境干燥的冬季，溫度、濕度和營養(yǎng)方面的條件不利于沙門氏菌生長，故其檢出率也隨之降低［18-19］。

有趣的是C1點的糞大腸桿菌數(shù)量在冬季較之夏季反而升高。其原因可能有以下2點，其一是該點位于人口密集的生活區(qū)內(nèi)，所以廢水污水及人畜糞便的排放可能是糞大腸桿菌的主要來源，另外即使是可行的垃圾處理過程也很難有效地減少源源不斷注入的生活垃圾［20］；其二是C1站位直接接收人口密集區(qū)的生活污水排放，污水從產(chǎn)生到入河的時間間隔很短，水體中細菌量主要受排放量控制。而夏、冬兩季污水排放量相當甚至冬季略高于夏季也是完全可能的?？傮w看來，河流糞大腸桿菌的數(shù)量大致在夏季較高，冬季較低。

指示微生物的監(jiān)測可以為環(huán)境水體中疾病的風險評價提供一定的依據(jù)。周淑玉等的研究表明，當污水中糞大腸菌群大于2.4×104m L-1時，沙門菌的陽性檢出率為84.3%，當糞大腸桿菌數(shù)量降為2.3～2.4×104m L-1時，沙門氏菌檢出率驟降至12.5%［21］，和本研究結(jié)果較為接近。而段衛(wèi)平等根據(jù)天津市污染水體中大腸菌群數(shù)與沙門菌的關(guān)系研究結(jié)果推測，當糞大腸菌群達到2.4×104m L-1時，沙門氏菌檢出率≥76.9%［22］，其估計值與本研究有較大的出入，其原因可能是天津與溫州的城市水體類型及污染成因不同，而且所使用方法的靈敏度存在差異。本研究結(jié)果顯示，在指示微生物含量低于104mL-1的水體中，傷寒沙門氏菌沒有檢出；而在有機污染嚴重的水體中，指示微生物的含量迅速增加，傷寒沙門氏菌相應(yīng)也具有較高的陽性檢出率；Savichtcheva O等的研究也證實了該結(jié)論［23］，這表明指示微生物在一定程度上可以反映水體中病原微生物的存在情況。指示微生物的監(jiān)測結(jié)果可以作為病原微生物污染狀況的一個初步表征，進而為環(huán)境水體中疾病的風險評價提供一定的依據(jù)。

4 小結(jié)

本研究運用快速的LAMP方法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，檢測和分析了不同季節(jié)溫瑞塘河環(huán)境水體中的糞大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和大腸埃希氏菌，證明了這些方法的有效性和實用性，為溫瑞塘河微生物指標的檢測提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為環(huán)境水體中病原微生物和指示微生物的研究分析提供了理論和實踐依據(jù)。

各個監(jiān)測點的糞大腸桿菌的檢出濃度大致為103～107m L-1，大腸埃希氏菌也大量存在于各個監(jiān)測點水體中，統(tǒng)計學結(jié)果表明，糞大腸桿菌與大腸埃希菌這2種指示微生物之間存在顯著相關(guān)性 （0.904）。傷寒沙門氏菌在水質(zhì)良好的三垟濕地和密集生活區(qū)內(nèi)的水體中陽性檢出率差異顯著，較常出現(xiàn)在污染嚴重的水體中，且當糞大腸桿菌的濃度為106m L-1以上時，傷寒沙門氏菌的陽性檢出率為100%。

糞大腸桿菌的數(shù)量在一定程度上能指示傷寒沙門氏菌的存在情況，這種關(guān)聯(lián)性說明在溫瑞塘河水環(huán)境中常用指示菌能夠用來表征病原菌的風險，但還需要更多的工作來明確不同環(huán)境條件下這種關(guān)聯(lián)是否存在差異。環(huán)境水體中沙門氏菌的污染是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的極大隱患，所以應(yīng)對沙門氏菌等水體病原菌進行長期的監(jiān)測，探究其來源和影響因素，以減少人們感染相關(guān)疾病的風險。

［1］ Cotruvo J A，Dufou r A，Rees G，et al.W aterborn zoonoses：identification，causes and control［M］.London：IWA Publishing，2004：242-255.

［2］ Dechesne M，Soyeux E.Assessment of source water pathogen contam ination［J］.Journal of Water and Health，2007，5（1）：39-50.

［3］ Ferguson A S，Layton A C，Mailloux B J，et al.Comparison of fecal indicators with pathogenic bacteria and rotavirus in groundwater［J］.Science of the Total Environment，2012，431：314-322.

［4］ Ahmed W，Neller R，Katouli M.Population similarity of en terococci and Escherichia coli in su rface waters：A predictive tool to trace the sources of faecal contam ination［J］.Journal of W ater and Health，2006，4（3）：347-356.

［5］ 王毳，同磊，曾慶祝.沙門氏菌的檢測技術(shù)與方法 ［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（5）：82-85.

［6］ 王哲.論沙門氏菌的檢測方法 ［J］.企業(yè)標準化，2008（9）：20.

［7］ Fleisher J M.Conducting recreational water quality surveys：some problems and suggested remedies［J］.Marine Pollution Bulletin，1990，21（12）：562-567.

［8］ Cheesbrough S，Donnelly C.The use of a Rapid Salmonella Latex Serogrouping Test（Spectate）to assist in the confirmation of ELISA-based Rapid Salmonella Screening tests［J］.Letters in Applied Microbiology，1996，22（5）：378-380.

［9］ 宋志文，孫群，徐愛玲，等.人工濕地中指示與病原微生物動態(tài)分布及相關(guān)性分析 ［J］.生態(tài)學雜志，2013，32（1）：91-97.

［10］ RajabiM，Jones M，Hubbard M，et al.Distribution and genetic diversity of Salmonella enterica in the Upper Suwannee River［J］.International Journal of Microbiology，2011：461321. doi：10.1155/2011/461321.

［11］ Anselmo R J，Viora S，Barrios H，et al.Serotipos de Sa lmonella Aislados del Río Lujan，Argentina［J］.Revista Latinoamericana De M icrobiologia-Mexico，1999，41（2）：77-82.

［12］ Adingra A A，Kouadio A N，BléM C，et al.Bacteriological analysis of surface water collected from the Grand-Lahou lagoon，C?te d’ivoire［J］.African Journal of Microbiology Research，2012，6（13）：3097-3105.

［13］ Jokinen C，Edge T A，Ho S，et al.Molecular subtypes of Campylobacter spp.，Salmonella enterica，and Escherichia coli O157：H7 isolated from faecal and surface water samples in the Oldman river watershed，Alberta，Canada［J］.Water Research，2011，45（3）：1247-1257.

［14］ Yam W C，Chan C Y，Ho Bella S W，et al.Abundance of clinical enteric bacterial pathogens in coastal waters and shellfish［J］.W ater Research，2000，34（1）：51-56.

［15］ Haley B J，Cole D J，Lipp E K.Distribution，d iversity，and seasonality of waterborne salmonellae in a rural watershed［J］. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（5）：1248-1255.

［16］ Abulreesh H H.Salmonellae in the environment［M］.INTECH Open Access Publisher，2012：19-50.

［17］ Haley B J，Cole D J，Lipp E K.Distribution，d iversity，and seasonality of waterborne salmonellae in a rural watershed［J］. Applied and Environmental M icrobiology，2009，75（5）：1248-1255.

［18］ 張彩虹，林波，李羅少，等.珠海市沙門氏菌性食源性疾病情況分析 ［J］.實用預防醫(yī)學，2005，12（4）：855-856.

［19］ 徐勝玲，蔡師志，湯國球.飲食 （服務(wù)）行業(yè)從業(yè)人員腸道沙門氏菌檢測結(jié)果分析 ［J］.熱帶醫(yī)學雜志，2006，6（6）：712-713.

［20］ Sibanda T，Chigor V N，Okoh A I.Seasonal and spatiotemporal distribution of faecal-indicator bacteria in Tyume River in the Eastern Cape Province，South Africa［J］.Environmental Monitoring and Assessment，2013，185（8）：6579-6590.

［21］ 周淑玉，王俊起，王京京.污水中大腸菌群數(shù)與沙門氏菌的關(guān)系 ［J］.衛(wèi)生研究，1987，16（1）：21-23.

［22］ 段衛(wèi)平，葉秀雯.天津城市污水中大腸菌群數(shù)與沙門氏菌的關(guān)系 ［J］.環(huán)境與健康雜志，2001，18（1）：25-26.

［23］ Savichtcheva O，Okabe S.Alternative indicators of fecal pollution：relations with pathogens and conventional indicators，currentmethodologies for direct pathogen monitoring and future application perspectives［J］.Water Research，2006，40（13）：2463-2476.

（責任編輯：侯春曉）

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A

0528-9017（2015）04-0448-05

10.16178/j.issn.0528-9017.20150402

2014-12-11

浙江省自然科學基金項目 （Y5110069）；溫州市科技計劃重點項目 （H20100052）；浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（2012R413025）；溫州市科技計劃項目 （S20100036）

陳勝藍。E-mail：454077194@qq.com。

商 栩。E-mail：copepod@sina.com。

文獻著錄格式：陳勝藍，尹紅果，陳夢清，等.環(huán)境水體中病原微生物與指示微生物的相關(guān)性研究 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56（4）：448-452，537.