SVF細(xì)胞影響移植脂肪LPL表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

樊 奇 鄭丹寧 余力王 健李鵬飛

SVF細(xì)胞影響移植脂肪LPL表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

樊 奇 鄭丹寧 余力王 健李鵬飛

目的探討脂肪移植后脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）在SVF（Stromal vascular fraction）輔助移植脂肪組織中的表達(dá)模式。方法本實(shí)驗(yàn)以新鮮分離的自體SVF細(xì)胞輔助移植的脂肪組織為實(shí)驗(yàn)組，以脂肪組織與等量生理鹽水的混合物為對照組，隨機(jī)在裸鼠背部兩側(cè)注射建立動物模型，對兩組移植物進(jìn)行脂周蛋白免疫組化染色分析、LPL免疫組化染色分析和LPL蛋白含量測定。結(jié)果LPL蛋白含量測定及LPL免疫組化染色分析顯示，隨著移植時間的延長，實(shí)驗(yàn)組和對照組LPL表達(dá)逐漸下降，在第2周、第3周、第4周時，實(shí)驗(yàn)組LPL表達(dá)明顯高于對照組。脂周蛋白免疫組化染色分析顯示，兩組脂肪移植后的存活細(xì)胞均逐漸減少，但第2周、第3周、第4周實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞數(shù)高于對照組。結(jié)論SVF促進(jìn)脂肪組織表達(dá)LPL，表達(dá)差異在移植后的第2周開始出現(xiàn)，這可能與SVF提高脂肪組織存活率和ASCs（Adipose-derived stromal cells）成脂分化有關(guān)。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪移植脂蛋白脂肪酶脂周蛋白

自體脂肪移植行軟組織充填時，90%的體積構(gòu)成為脂肪細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油，最終體積取決于成活的脂肪細(xì)胞數(shù)量和三酰甘油含量。既往研究更多的是針對提高脂肪細(xì)胞的存活數(shù)量[1-4]，對于提高三酰甘油含量（即生脂調(diào)控）缺乏針對性的措施。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法提取脂肪基質(zhì)血管組分（SVFs），與人體脂肪混合移植于裸鼠，以添加生理鹽水的脂肪組織移植為對照。通過比較脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）的表達(dá)差異，探索SVF對于LPL表達(dá)的作用，以及可能的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡雌性裸鼠8只（本院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體質(zhì)量15.6～21.6 g（平均18.8 g）。

L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（HyClone公司）；抗脂蛋白脂肪酶抗體（Abcam公司）；脂周蛋白抗體（LSBio公司）；山羊抗兔二抗、BCIP/NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）；0.2 μm PVDF膜（Millipore公司）；Marker、Ⅰ型膠原蛋白酶（Sigma公司）、5×loding-buffer（Takara公司）；EpiQuickTM全組蛋白抽提試劑盒（EpiQuick公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪組織的獲取

脂肪組織來源于一名健康成年女性，通過抽脂術(shù)獲取皮下脂肪。在超凈工作臺內(nèi)將抽取后的混合物以生理鹽水洗滌3次，并靜置分層。用10 m L注射器吸取10 m L脂肪顆粒置于無菌的三角燒瓶中；加入10 m L 0.075%Ⅰ型膠原酶，搖勻后置于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)50 min；后將混合物600 g，離心10 min，倒掉上層油脂及液體，用生理鹽水將沉淀物懸浮，再次600 g，離心10 min。用移液器將上層液體吸出，剩余沉淀物即為基質(zhì)血管成分（SVF）。將獲得的SVF細(xì)胞與脂肪組織混合，得到10 mL富含SVF細(xì)胞的混合物。另外留取2 mL洗凈沉淀的脂肪組織作為移植前的樣品放置于液氮中備用。20 mL混合物600 r/min，離心10 min，取中間的脂肪層。將與上述SVF懸液等量的生理鹽水與自體脂肪顆粒混合得到10 m L注射脂肪，作為對照組。

1.2.2 脂肪移植模型的建立

2%戊巴比妥鈉50 mg/K g腹腔注射麻醉裸鼠，用注射器連接18號針頭將1 m L SVF混合自體脂肪顆粒（實(shí)驗(yàn)組）與1 m L生理鹽水自體脂肪顆?；旌衔铮▽φ战M），按隨機(jī)化原則分別注射于8只裸鼠背部的左側(cè)或右側(cè)，并標(biāo)記。

1.2.3 脂肪移植物存活的評價

分別在移植1周、2周、3周、4周后取材，大體觀察移植物的形態(tài)，有無感染、壞死等現(xiàn)象。部分脂肪用于Western Blot檢測，迅速保存于液氮中，部分置于4%多聚甲醛中固定，浸蠟、包埋、切片，用于HE染色與免疫組化。

1.2.4 LPL表達(dá)的W estern blot檢測

對所取得組織蛋白進(jìn)行蛋白初定量。配置分離膠和濃縮膠。向泳道中注入蛋白樣本，然后電泳分離蛋白。將膠放于負(fù)極，轉(zhuǎn)膜裝置浸沒在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，4℃轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜制得的承載膜置于5%BSA中封閉，脂蛋白脂肪酶和內(nèi)參抗體過夜后加螢光二抗。TBST清洗后掃描儀掃描并截圖分析。得到去除背景的灰度圖像，計算目的條帶的陰影。

1.2.5 HE染色

標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋，切片（5 μm厚），HE染色，鏡下觀察。

1.2.6 LPL免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片常規(guī)脫水至水化，PBS沖洗5 min，3次，3%過氧化氫封閉10 min，高溫修復(fù)抗原（沸水浴30 min），自然涼至室溫，PBS沖洗5 min，3次，正常山羊血清37℃封閉30 min，一抗孵育（1∶200），4℃過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG），37℃20 min，辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素（三抗），37℃30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。

1.2.7 脂周蛋白免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片常規(guī)脫水至水化，PBS沖洗5 min，3次，3%過氧化氫封閉10 min，高溫修復(fù)抗原（沸水浴30 min），自然涼至室溫，PBS沖洗5 min，3次，正常山羊血清37℃封閉30 min，一抗孵育（1∶200），4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗（兔抗羊IgG），37℃20 min，滴加AP，30 min后生理鹽水洗3次，堿性磷酸酶染色劑染30 min左右，自來水沖洗10～15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。深藍(lán)色為陽性結(jié)果。

1.2.8 統(tǒng)計處理

采用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料中正態(tài)分布數(shù)據(jù)用x±s表示，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)，上四分位數(shù)～下四分位數(shù)（M，P25～P75）表示，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察

植入后1周，可見實(shí)驗(yàn)組與對照組脂肪團(tuán)塊都有血管長入。隨著時間的延長，兩組脂肪移植物，尤其是對照組，體積逐漸變小，移植物表面油滴增多。植入后2周，可見脂肪組織外側(cè)出現(xiàn)纖維囊包裹；隨著時間延長，脂肪組織外側(cè)纖維囊逐漸增厚。

2.2 LPL的Westen Blot結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組LPL在1周、2周、3周和4周相對表達(dá)水平為（1.64±0.12）、（1.53±0.13）、（1.21±0.21）和（1.12±0.18）；對照組LPL為（1.59±0.14）、（0.65±0.14）、（0.52±0.13）和（0.47±0.13）。提示1周時兩組無顯著差異，2周、3周和4周兩組差異顯著（圖1）。

2.3 LPL免疫組化染色結(jié)果

光鏡下觀察，存活的脂肪細(xì)胞、纖維結(jié)締組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞可表達(dá)LPL。在移植前可見脂肪組織完整，脂蛋白脂肪酶陽性細(xì)胞存在（圖2）。第1周，實(shí)驗(yàn)組和對照組鏡下無明顯差異；第2周，實(shí)驗(yàn)組和對照組LPL表達(dá)增加，且實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組；第3周，鏡下可見實(shí)驗(yàn)組和對照組纖維結(jié)締組織增生明顯，對照組纖維化高于實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)LPL的細(xì)胞密度高于對照組；第4周，兩組纖維化更加明顯，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)LPL的細(xì)胞密度高于對照組，但是總體兩組都呈下降趨勢（圖3）。

2.4 脂周蛋白免疫組化染色結(jié)果

光鏡下可見存活脂肪細(xì)胞脂滴周邊區(qū)域陽性表達(dá)，為圓環(huán)狀。移植前，脂周蛋白在脂肪細(xì)胞上呈強(qiáng)陽性環(huán)形表達(dá)（圖4）。移植后1周，兩組無明顯差異；移植后2周，可見脂肪細(xì)胞脂滴周圍脂周蛋白表達(dá)下降，表達(dá)區(qū)域界限模糊，對照組脂周蛋白表達(dá)的下降幅度比實(shí)驗(yàn)組更加明顯，細(xì)胞間隙比對照組更寬；移植后3周，可見實(shí)驗(yàn)組和對照組都呈缺血性壞死，實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞數(shù)量高于對照組；移植后4周，可見間質(zhì)組織增生，前體脂肪細(xì)胞散布其中；移植后4周，兩組存活的脂肪細(xì)胞數(shù)量下降，前體脂肪細(xì)胞增加，實(shí)驗(yàn)組的前體細(xì)胞數(shù)量大于對照組（圖5）。

圖1 移植早期脂蛋白脂肪酶W estern blot變化趨勢Fig.1 The trends of LPL exp ression in the early stage after adipose transp lantation by W estern blot

圖2 移植前LPL免疫組化Fig.2 The results of LPL immunohistochem istry beforeadipose transp lantation

圖3 移植后早期LPL免疫組化Fig.3 The results of LPL immunohistochem istry in the early stage after adipose transplantation

圖4 移植前脂周蛋白免疫組化Fig.4 The results of perilipin immunohistochem istry before adipose transp lantation

圖5 移植后早期脂周蛋白免疫組化Fig.5 The results of perilipin imm unohistochem istry in the early stage after adipose transp lantation

3 討論

脂肪注射已廣泛應(yīng)用于美容及整復(fù)手術(shù)。但是脂肪移植物具有較高的吸收率和較低的存活率，移植時仍需矯枉過正或重復(fù)注射，以達(dá)到滿意的效果。

目前，脂肪組織的獲得、提取和保存等都有了相應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)證明，血供是脂肪存活的重要因素[5-7]。Yoshimura等[4]利用SVF輔助脂肪移植以改善脂肪移植效果，引起廣泛關(guān)注。用膠原酶處理脂肪組織，可得到大量的SVF細(xì)胞，SVF細(xì)胞經(jīng)離心、培養(yǎng)可獲得ASCs。通過自體培養(yǎng)可得到大量ASCs，但是培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜，培養(yǎng)周期長，污染風(fēng)險性大，而且需要一期獲取ASCs，二期獲得脂肪，將兩者混合植入。而SVF細(xì)胞可一期實(shí)現(xiàn)移植，具有更高的安全性[4，8]。鑒于SVF更為廣泛的臨床應(yīng)用范圍，我們認(rèn)為針對SVF輔助移植的研究更具有現(xiàn)實(shí)意義，而且SVFs輔助移植與ASCs輔助移植具有共同的效果。

LPL是脂質(zhì)代謝中最重要的酶之一[9]，主要由脂肪和肌肉細(xì)胞合成后分泌至細(xì)胞外，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近毛細(xì)血管內(nèi)皮表面的硫酸類肝素上，錨定于此處發(fā)揮生理功能。通過一系列生理作用，外源性甘油三酯轉(zhuǎn)化為自由脂肪酸，進(jìn)入脂肪細(xì)胞中，再發(fā)生一系列變化，成為脂肪細(xì)胞本身的甘油三酯。脂蛋白脂肪酶發(fā)揮作用使得機(jī)體各種組織能夠利用來自食物攝取和肝臟合成的脂肪。但是各組織的脂蛋白脂肪酶對機(jī)體脂質(zhì)代謝的作用各不相同。目前普遍認(rèn)同的是白色脂肪組織（WAT）中的LPL活性升高有助于機(jī)體脂質(zhì)的貯存，棕色脂肪組織（BAT）的LPL則與機(jī)體產(chǎn)熱有關(guān)，而骨骼肌的LPL活性升高有利于機(jī)體利用能量。LPL在脂肪組織（AT）中的活性及其在肌肉組織內(nèi)的相對活性決定了脂肪是用于貯存或是供能。而與脂肪移植密切相關(guān)的是白色脂肪。LPL在人體內(nèi)分泌代謝研究中是重要的研究對象，但涉及該關(guān)鍵酶含量和活性變化的報道卻較少。Hudson等[10]通過比較人體不同部位脂肪組織LPL的活性和脂肪細(xì)胞大小來確定較好的脂肪供區(qū)，認(rèn)為大腿部的脂肪組織最適合于脂肪移植。Yost等[11]比較抽脂術(shù)前后人體血清中LPL的表達(dá)和活性，認(rèn)為抽脂術(shù)后3個月內(nèi)人體血清中LPL表達(dá)升高，與體重降低后的代償相關(guān)。此外，未發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)報道。

在脂肪組織中表達(dá)LPL的細(xì)胞包括成熟脂肪細(xì)胞，前體脂肪細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，SVF可提高脂肪組織的LPL表達(dá)，并且移植后2周開始，對照組和實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)差異性變化，究其原因，應(yīng)當(dāng)結(jié)合ASCs在脂肪存活中的分化機(jī)制來探討。ASCs在脂肪存活中具有如下作用：①ASCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，加速脂肪移植物的血管化和再成活[12-13]。新鮮分離的自體SVFs或培養(yǎng)的自體ASCs均參與脂肪移植物的血管化進(jìn)程。而ASCs在脂肪移植物的血管化進(jìn)程中的作用一般在移植1周左右開始顯現(xiàn)，血管密度的增加提高了脂肪細(xì)胞的存活率[14]，從而提高了LPL表達(dá)陽性細(xì)胞的存活率。②ASCs可分化成脂肪細(xì)胞，成為脂肪移植物的組成部分。ASCs與脂肪細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)有利于ASCs向脂肪細(xì)胞的分化[15-16]，1～2周內(nèi)，LPL mRNA開始表達(dá)升高并可持續(xù)于整個誘導(dǎo)過程，而非成脂誘導(dǎo)干細(xì)胞的LPL表達(dá)則可忽略不計。本實(shí)驗(yàn)第2周開始，實(shí)驗(yàn)組LPL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯升高，可能與SVF提高脂肪組織中脂肪前體細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，前體細(xì)胞血管密度增加后，在有較充分氧氣和營養(yǎng)的情況下需要大量貯存甘油三酯而使得LPL含量大幅增加。

組織學(xué)和Western blot檢測可以看出，盡管SVF可提高早期LPL表達(dá)，但比起移植前脂肪組織，LPL表達(dá)仍是下降的。由此可見，盡管SVF可以提高細(xì)胞生存率，提高LPL表達(dá)，但無法改變移植早期在缺血缺氧的條件下脂肪細(xì)胞大量壞死的趨勢。

總之，SVF可提高脂肪細(xì)胞遠(yuǎn)期存活率，促進(jìn)LPL表達(dá)和細(xì)胞成脂，提高脂肪移植效果。今后我們將繼續(xù)研究相關(guān)機(jī)制和SVF的作用方式，進(jìn)一步探索促進(jìn)脂肪組織LPL表達(dá)及促進(jìn)脂肪細(xì)胞成脂的方法，為改進(jìn)脂肪移植效果提供新的策略。

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Effect of SVF Cells on the LPL Expression after Fat Transp lantation

FAN Qi,ZHENG Danning,YU Li,WANG Jian, LI Pengfei.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHENG Danning(E-mail:zhengdan218@hotmail.com).

Objective To explore the effect of adipose stromal vascular fraction(SVF)cells on the LPL expression after fat transplantation.M ethods Freshly isolated SVFs(experimental group)were mixed with adipose tissue and then injected under the back skin of nudes random ly on one side.In the same manner,the mixture of physiological saline and adipose tissue(control group)were injected on the other side.Immunohistochem istry for perilipin,immunohistochem istry for LPL and western blot for LPL were combined to explore the trends of LPL expression at 1,2,3 and 4 weeks.Results According to the results of western blot and immunohistology of LPL,the levels of LPL started to decrease as early as the transplantation in both groups.And the expression of LPL in the experimental group was higher than the control group at 2,3 and 4 weeks after implantation.Immunohistology of perilipin indicated no remarkable changes in the viable adipocyte zone during the first week.The adipose cells decreased day to day in both group.And 2,3 and 4 weeks after implantation there were more survived adipose cell in the experimental group.Conclusion SVF can improve the expression of LPL in transplanted adipose tissue.It begins to make effects at the second week post-implantation.It may be related to its effect on the adipose cell survival and the adipogenic differentiation of ASCs.

Adipose-derived stromal cells;Fat transplantation;Lipoprotein lipase;Perilipin

R622+.9

A

1673－0364（2015）03－0148－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.008

2015年3月21日；

2015年5月6日）

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

鄭丹寧（E-mail：zhengdan218@hotmail.com）。