左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養(yǎng)小鼠足細胞凋亡及Caspase-12表達的影響

陳 聰，吳勇軍，喻 嶸*，唐 元，羅文娟，曾 婧，張 翔

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

足細胞是糖尿病腎病 （Diabetic nephropathy，DN）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶細胞之一，足細胞的損傷和剝脫，與DN 早期發(fā)病相關(guān)，明顯早于腎小球硬化和腎間質(zhì)病變[1-2]。 細胞凋亡是足細胞丟失的重要原因之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號分子Caspase-12 的活化與細胞凋亡密切相關(guān)[3-4]。 高糖環(huán)境是引起足細胞凋亡及（或）死亡的原因之一，其具體分子機制尚不清楚[4-5]。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方左歸降糖益腎方可以改善糖尿病腎病MKR 鼠腎功能， 保護足細胞結(jié)構(gòu)[6]。 本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進一步探討經(jīng)高糖處理體外足細胞后，足細胞損傷的可能分子機制，并為糖尿病腎病的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng) 小鼠足細胞購自北京協(xié)和細胞中心（Mouse podocyte；3111C0001CCC000230）。 以含10%胎牛血清，90%的DMEM 完全培養(yǎng)基 （含100 U/mL 青 霉 素、100 μg/mL 鏈 霉 素、25 mmol/L葡萄糖）在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間2～3 d更換培養(yǎng)液1 次，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，待細胞體積明顯增大，向四周伸出足突分化成熟后用于實驗。

1.1.2 動物 Wistar 大鼠40 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司， 飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，許可證號：SYXK(湘)2013-0005）。

1.1.3 主要試劑 總RNA 提取試劑盒， 購自天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Fermentas公司；PCR 引物，由上海生工公司合成；葡萄糖（分析純），購自上海國藥集團化學試劑有限公司；兔抗小鼠Caspase-12 多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33258 熒光染料， 購自合肥博美生物科技有限責任公司；AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，購自深圳欣博盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器 WD-9402 A 型PCR 擴增儀， 購自北京六一儀器廠；F1-F2 Fuses Type T2A 型化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)， 購自Bio-Rad 公司；BioPhotometer plus 型核酸蛋白分析儀， 購自Eppendorf 公司；Aria2 型流式細胞檢測儀， 購自BD 公司；A1 型激光共聚焦顯微鏡，購自尼康公司。

1.1.5 含藥血漿制備 左歸降糖益腎方： 由熟地黃、黃芪、山藥等9 味藥組成(中藥湯劑制備：經(jīng)水煎煮2 次， 混合， 濾過， 濃縮制備成含生藥濃度為2 g/mL 的藥液，經(jīng)滅菌后置4 ℃冰箱中備用)。 大鼠按隨機原則分為空白組、左歸降糖益腎方組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸 （4-Phenylbutyric acid，4-PBA）組，每組10 只，連續(xù)7 d 灌胃給藥，1 次/d。按人與大鼠體表面積換算法計算給藥量，中藥給藥劑量為30 g/kg，相當于臨床人用劑量的3 倍，灌胃容量為15 mL/kg；4-PBA 生理鹽水稀釋， 濃度為0.20 g/mL，劑量為3 g/kg，灌胃容量為15 mL/kg；空白血漿采集于不給藥動物。 末次給藥后1 h 腹主動脈 插 管 取 血，7.5% EDTA·Na2抗 凝， 收 集 血 漿0.22 μm 濾膜過濾，56 ℃水浴滅活30 min 后，分裝置-20 ℃冰箱備用。

1.2 方法

用完全培養(yǎng)基調(diào)細胞密度為1×105/mL 的細胞懸液，然后轉(zhuǎn)種培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基總體積5 mL，放入5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液同步化處理12 h 后，分為空白組(A 組)、高糖組(B 組)、左歸降糖益腎方含藥血漿組(C 組)、4-PBA 含藥血漿組(D 組)。 A 組為終濃度25 mmol/L 葡萄糖，含10%空白血漿的DMEM 培養(yǎng)基；B 組為終濃度200 mmol/L 葡萄糖， 含10%空白血漿的DMEM 培養(yǎng)基；C 組、D 組含藥血漿組，分別為10%含藥血漿，終濃度200 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基。 根據(jù)課題組預(yù)實驗結(jié)果， 選擇在48 h 后收集細胞。 用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化細胞， 加入完全培養(yǎng)基終止消化， 離心管收集細胞懸液，1 000 r/min，5 min 離心， 棄上清； 用PBS 洗滌細胞沉淀2～3 次，1 000 r/min，5 min 離心，棄上清；置冰上，用于Western blot，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)等相關(guān)檢測。

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 用總RNA 提取試劑盒抽提其總RNA，采用核酸蛋白分析儀測定其濃度。 取1 μg 總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo（dT）為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因。 應(yīng)用Primer 5.0 軟件，根據(jù)GenBank 中小鼠的序列設(shè)計引物。

Caspase-12： 上 游5’-TGGCCCATGAATCACATCTA-3’。

下游5’-TGTTGCAGATGATGAGAGCC -3’，產(chǎn)物183 bp。

GAPDH： 上 游5’-ACTTGAAGGGTGGAGCCAAA-3’。

下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACA-3’， 產(chǎn)物608bp。

Caspase-12： 預(yù)變性，94 ℃，10 min；94 ℃變性40 s，51.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)； 最后72 ℃延伸7 min。 GAPDH： 預(yù)變性，95 ℃，5 min；94 ℃變 性30 s，60 ℃退 火30 s，72 ℃延伸30 s， 共28個循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad 化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶光密度值，以Caspase-12 和GAPDH 電泳條帶光密度值比值計算Caspase-12 mRNA 相對表達量。實驗重復(fù)三次，取均值。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法 按試劑盒操作提取總蛋白，蛋白樣品100 ℃變性10 min 后， 用50 μg 蛋白樣品電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜90 min， 將轉(zhuǎn)有蛋白的膜置于5%脫脂奶粉中封閉（用TBST 稀釋奶粉），4 ℃過夜，不洗，置于兔抗小鼠Caspase-12 多克隆一抗(1∶500，TBST稀釋)中孵育2 h，TBST 洗3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶1000，TBST 稀釋)，室溫孵育1～2 h，TBST 洗3 次，每次10 min。 加入ECL 化學發(fā)光試劑，Bio-Rad 化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)以目的條帶光密度值與同個樣品的GAPDH（GAPDH 內(nèi)參1∶2000，用TBST 稀釋）光密度值的比值表示目的基因蛋白表達水平。 實驗重復(fù)3 次，取均值。

1.2.3 流式細胞術(shù) 收集細胞， 調(diào)細胞密度為1×106/mL， 按AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，由專業(yè)人員按流式細胞檢測儀操作步驟檢查。 實驗重復(fù)3 次，取均值，足細胞總凋亡率=早期凋亡率+中晚期凋亡率。

1.2.4 免疫熒光細胞化學法 在無菌狀態(tài)下，將防脫蓋玻片分別放入6 孔培養(yǎng)板中。 每孔均勻加入含細胞1×105/mL 的完全培養(yǎng)基懸液1 mL， 放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基同步化處理12 h 后， 分為A 組、B 組、C 組、D組。 分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基，48 h 后收集細胞，用PBS洗滌5 min，3 次， 加入4%多聚甲醛固定 （25～30 min），PBS 洗滌5～10 min，3 次。 用1%曲拉通X-100（PBS 配制）打孔，2～5 min，PBS 洗3 次，每次5～10 min。Hoechst 33258 染核（1∶400，PBS 稀釋），室溫放置15 min，PBS 洗3 次，每次10 min，晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下拍片。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性檢驗，采用單因素方差分析；若不滿足，則采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis 檢驗)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以“±s”表示。

2 結(jié)果

2.1 足細胞觀察情況

A 組細胞核呈較均勻的藍色熒光， 核仁較清晰；B 組凋亡細胞核呈致密濃染， 或呈碎塊狀致密濃染。C 組與D 組細胞凋亡情況較B 組改善。見第72 頁彩圖圖1。

2.2 各組凋亡率比較

流式細胞儀檢測將各組細胞分為4個細胞亞群：正常存活細胞(左下象限，Q3)，早期凋亡細胞(右下象限，Q4)，中晚期凋亡細胞(右上象限，Q2)，壞死細胞(左上象限，Q1)。 與A 組比，B 組足細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與B 組比，C 組與D 組足細胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與C 組比較，D 組凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表1，圖2。

表1 足細胞凋亡率的變化 （±s，n=3）

表1 足細胞凋亡率的變化 （±s，n=3）

注：與A 組比較▲P＜0.05；與B 組比較★P＜0.05；與C 組比較■P＜0.05。 下表同。

組別A 組B 組C 組D 組足細胞凋亡率（%）9.80±1.28 39.77±2.51▲18.27±1.07▲★11.00±1.28★■

2.3 各組Caspase-12 表達的比較

Western blot 及RT-PCR 法顯示： 與A 組比，B組足細胞Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與B 組比，C組與D 組Caspase-12 蛋白及mRNA 表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但C 組與D組比較，Caspase-12 蛋白及mRNA 表達水平， 差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2，圖3。

表2 各組Caspase-12 蛋白、mRNA 表達的比較 （±s，n=3）

表2 各組Caspase-12 蛋白、mRNA 表達的比較 （±s，n=3）

組別A 組B 組C 組D 組Caspase-12 蛋白/GAPDH 0.54±0.06 1.23±0.12▲0.84±0.16▲★0.86±0.11▲★Caspase-12 mRNA/GAPDH 0.35±0.02 0.83±0.04▲0.58±0.10▲★0.55±0.12▲★

3 討論

圖2 AnnexinV-FITC／PI 雙染法檢測不同組足細胞凋亡

圖3 各組Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平變化

糖尿病腎?。―N）是糖尿病全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，也是糖尿病的主要死亡原因之一，已成為導致終末期腎衰竭的第二病因，僅次于腎小球腎炎[7-8]。 足細胞是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵靶細胞之一。 細胞凋亡是導致足細胞丟失的重要因素[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （ERS） 是一種新的引起細胞凋亡的途徑， 也是造成DN 腎組織足細胞損傷的重要機制之一[10-11]。 Caspase-12 家族是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中最終執(zhí)行凋亡的水解酶類。 Caspase-12 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，與其他的Caspases 一樣以無活性的酶原形式存在。ERS 引起Caspase-12 激活，而死亡受體或線粒體凋亡途徑中Caspase-12 不被活化。激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，活化的Caspase-9 激活Caspase-3 等效應(yīng)Caspases，導致細胞凋亡[3]。Cao Y 等[4]研究發(fā)現(xiàn)高劑量D-葡萄糖分別刺激體外小鼠足細胞后，Caspase-12 蛋白或mRNA 的表達水平在48 h達高峰，并與足細胞凋亡率正相關(guān)。

本實驗用葡萄糖200 mmol/L 體外處理足細胞48 h 后，發(fā)現(xiàn)與正常葡萄糖組比：足細胞凋亡率升高，Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平升高。 證實高糖是造成足細胞凋亡的原因之一，足細胞凋亡的分子機制之一是Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平升高。 經(jīng)左歸降糖益腎方含藥血漿干預(yù)后，足細胞凋亡率，Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平較高糖組明顯降低。 同時，與陽性對照4-PBA 含藥血漿組比較， 在降低Caspase-12 蛋白及mRNA的表達水平方面，具有相似的作用。

DN 的中醫(yī)病機課題組認為： 主要病理機制為氣陰兩虛，夾熱毒瘀血。 治療上，針對糖尿病腎病的“虛、毒、瘀”病機，采用標本兼治的方法，補脾益腎、滋陰益氣以治本，解毒活血以治標。 左歸降糖益腎方由熟地、黃芪、丹參、玉米須等組成，方中重用熟地滋陰養(yǎng)腎為主藥，以填真陰；黃芪等益氣健脾；丹參活血化瘀；玉米須等清熱利濕，利尿消腫；諸藥合用，共奏滋陰益氣，活血解毒，利尿消腫之功效。 課題組前期研究表明滋陰益氣、 健脾固腎以扶正固本，活血解毒以治標實，可改善或解除炎癥因子、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等賴以產(chǎn)生和發(fā)展的條件，延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[6，12-14]。 本實驗發(fā)現(xiàn)左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過降低高糖誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡因子Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平，降低足細胞凋亡率，從而保護足細胞。 而目前，DN 的發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡明， 中醫(yī)藥在DN 的治療方面進行了諸多有益的探索，療效肯定。 因而，左歸降糖益腎方含藥血漿在其他方面的治療作用值得進一步研究。

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