瘧原蟲厚血膜染色方法的改良

唐瓊?cè)A 梁志江 何偉業(yè) 楊平英

唐瓊?cè)A 梁志江 何偉業(yè) 楊平英:廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院廣東廣州 510405

瘧疾是由瘧原蟲感染人體而引起的一種惡性傳染病，它廣泛分布于熱帶和亞熱帶各國(尤其是亞非拉各發(fā)展中國家)，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，2010 年在全球106 個瘧疾流行國家和地區(qū)，共有2.16 億瘧疾病例，65.5 萬人死于瘧疾［1］。且隨著全球氣候的變暖，這一寄生蟲病正有向北遷移的趨勢，有報道稱美國研究人員于2012 年在美國最北部的阿拉斯加州發(fā)現(xiàn)一例禽瘧疾［2］。在我國，經(jīng)政府的多年努力，國內(nèi)疫情已得到基本控制，但仍不時有一些散在病例的發(fā)現(xiàn)，且多為輸入性病例。為防止其在國內(nèi)傳播蔓延，對受感染者盡早地診斷和進行隔離治療是非常有必要的。根據(jù)WHO 的標(biāo)準(zhǔn)，實驗室診斷是瘧疾確診的基礎(chǔ)，目前實驗室診斷瘧疾的方法有厚、薄血膜顯微鏡檢查法、快速抗原檢測、PCR、離心分層定量分析法(Quantitative Buff Coat，QBC)和血清學(xué)檢查等方法，其中顯微鏡同時檢查厚血膜和薄血膜仍是診斷瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。但此方法對實驗室工作人員的要求較高，尤其是其中厚血膜的制作和染色較難把握，稍有不慎，極易因涂片過厚而導(dǎo)致溶血不完全或染色不佳。為找出一種便于掌握、效果較佳的厚血膜的制作方法，筆者與同事在長期的工作實踐中，對血涂片查找瘧原蟲厚血膜的制作和染色進行了部分改良，在此與各位同行分享。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

EDTA－K2抗凝外周血標(biāo)本，玻片，瑞氏染液(可自配或購買商品化試劑)，吉姆薩染液，蒸餾水，OLYMPUS BX40 型光學(xué)顯微鏡。

1.2 染色方法

1.2.1 取全EDTA－K2抗凝血標(biāo)本，搖勻后用加樣槍取10 uL抗凝血在干凈玻片上涂開成一直徑約為1.5 cm 左右、厚薄均勻的圓形厚血膜，平放晾干。每份標(biāo)本制成兩張厚血膜片。

1.2.2 根據(jù)抗凝血標(biāo)本血紅蛋白的量將瑞氏染液和蒸餾水按比例配制成待用染液，其比例關(guān)系見表1。

1.2.3 制好的兩張片中，一張按傳統(tǒng)厚血膜染色法用吉姆薩染色，另一張則將按上面比例配好的染液混勻覆蓋在已晾干的厚血膜上，染色10 min 后用蒸餾水輕輕將液染沖走，玻片晾干待檢。

1.2 重復(fù)性和穩(wěn)定性驗證

隨機選取5 名實驗室技術(shù)人員和5 名實習(xí)同學(xué)接受此染色方法培訓(xùn)后，每人均用已知瘧原蟲陽性和陰性EDTA －K2抗凝血標(biāo)本制備厚血膜4 張(每份標(biāo)本2 張)，并采用本方法配制染液和進行染色，制得40 張厚血膜片，將此40 張片改變順序交由另兩位形態(tài)學(xué)經(jīng)驗豐富的同事油鏡下檢查并評價，以評估此染色方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表1 血紅蛋白量與染液配制比例的關(guān)系

2 結(jié)果

2.1 此改良后染色方法與傳統(tǒng)的吉姆薩染色法染色效果的比較

由圖1 和圖2 可見，改良后方法制作染色的瘧原蟲厚血膜片(油鏡下)與傳統(tǒng)方法制作染色的瘧原蟲厚血膜片(油鏡下)相比，染出來的血膜在鏡下背景干凈，蟲體清晰，易于分辨。兩種方法比較結(jié)果見表2。

圖1 傳統(tǒng)方法制作染色的瘧原蟲厚血膜片(油鏡下)

圖2 改良后方法制作染色的瘧原蟲厚血膜片(油鏡下)

表2 傳統(tǒng)方法與改良后的染色方法比較

2.2 重復(fù)性與穩(wěn)定性的評估結(jié)果

隨機選取5 名本科室實驗室技術(shù)人員和5 名實習(xí)同學(xué)采用此改良方法進行厚血膜染色，陰、陽性標(biāo)本均染出了背景清晰，易于辨認(rèn)的合格的厚血膜片。且5 名本科室實驗室技術(shù)人員和5 名實習(xí)同學(xué)染的厚血膜片之間無顯著差異，證明此染色方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，易于掌握。

3 討論

瘧疾被WHO 列為頭號熱帶傳染病，它是由瘧原蟲寄生于人體、經(jīng)媒介按蚊傳播、引起以周期性發(fā)冷、發(fā)熱、出汗等癥狀和脾大、貧血等體征為特點的寄生蟲病，分為間日瘧、惡性瘧、三日瘧和卵形瘧4 種。瘧疾的實驗室診斷有病原學(xué)診斷(厚、薄血膜染色鏡檢找到原蟲)、免疫學(xué)診斷(循環(huán)抗原抗體的檢測)、分子生物學(xué)技術(shù)PCR 和核酸探針檢測三種方法，其中以病原學(xué)診斷(厚、薄血膜染色鏡檢找到原蟲)最為可靠易行［4］。而在病原學(xué)診斷中，厚血膜法由于查找原蟲所用血量多，蟲體密集，陽性率遠(yuǎn)高于薄血膜法。但傳統(tǒng)的厚血膜制作染色方法需要先用蒸餾水溶血后再采用吉姆薩染色法染色，步驟較多操作繁瑣，不易掌握，對實驗室工作人員的技術(shù)和經(jīng)驗要求較高，對于新手來說按此方法制作出一張滿意的厚血膜并不容易，且此方法制作出的厚血膜鏡下雜質(zhì)較多，對于原蟲的查找會造成一定的干擾，既延長了檢測的時間，又容易造成漏檢。也曾有同行試過采用染缸一步染色法染厚血膜［5］，但染缸法適合于批量染色，且若有血膜脫落易于造成標(biāo)本間的污染。而經(jīng)筆者改良后的方法將溶血與染色合為一步完成，每張血膜單獨染色，無污染風(fēng)險，步驟簡單，操作方便，只需10 min，易于掌握，染出的厚血膜背景干凈，蟲體清晰，易于分辨。且此改良方法只用實驗室常規(guī)血涂片采用的瑞氏染液即可，無需另行購置或配制吉姆薩染液，這樣既為實驗室縮短了瘧原蟲的檢測時間，提高了檢測的陽性率，又節(jié)約了檢測成本，可謂一舉數(shù)得。

衛(wèi)生部WS259 －2006 和美國CLSI M15 －A 標(biāo)準(zhǔn)中推薦的瘧原蟲厚血膜常規(guī)染色法(先溶血后染色)同樣適用于錐蟲和巴貝氏蟲等其它血液寄生蟲的檢查［6］，但因本科無其它血液寄生蟲陽性標(biāo)本，尚無法證實此染色方法是否適用于錐蟲等其它血液寄生蟲。

［1］ WHO.World malaria report 2011［R］.2011.

［2］ 新華社.研究稱全球變暖導(dǎo)致禽瘧疾北移［EB/OL］.(2012 －9－20)［2015 －03 －01］. http://tech. gmw. cn/2012 －09/20/content_5134514.htm.

［3］ GILLES H M，WARRELL D A. Bruce－Chwatt’s essential malariology［M］. London:Arnold，1993.

［4］ 韋 林.瘧原蟲血液濃集法的改進［J］.臨床檢驗雜志，2011，15(5):267.

［5］ 王厚芳.瘧原蟲檢查厚血膜染色方法的建立及臨床應(yīng)用［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，35(12):1191.

［6］ 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3 版.南京:東南大學(xué)出版社，2006:242 －243.