紫色桿菌素研究與開發(fā)進展

李 紅,蔡友華,陸最青,鄭彩珠

（廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，廣東 肇慶 526040）

紫色桿菌素是微生物的一種次級代謝產(chǎn)物，屬于吲哚衍生物，由2個色氨酸分子氧化縮合而成，是一種非極性的藍黑色素，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和四氫呋喃等有機溶劑，一般選擇乙醇作為紫色桿菌素的提取溶劑.1882年，Boisbaudran[1]首次發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素.研究發(fā)現(xiàn)，紫色桿菌素具有很多重要的生物活性，在醫(yī)藥、食品和紡織等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景.本文中，筆者對紫色桿菌素的生物合成分子機制、基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵、生物活性及其應(yīng)用前景作一綜述.

1 紫色桿菌素的生物合成

目前所發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)紫色桿菌素的微生物均屬于細菌.19 世紀(jì)末，人們首次發(fā)現(xiàn)Chromobacterium violaceum 能夠產(chǎn)紫色桿菌素[2-3]，隨后，其他產(chǎn)紫色桿菌素的微生物也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并分離出來，包括C.fluviatile，Alteromonas luteoviolacea，Pseudoalteromonas luteoviolacea,Pseudomonas sp.520P1 和Ps.sp.710P1，Duganella sp.B2，Jan th inobacterium lividum XT1.C.violaceum 作為最早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫色桿菌素的菌株，其相關(guān)研究最為廣泛，屬于革蘭氏陰性菌，是一種對動物和人類的機會致病菌，能夠?qū)е聰⊙?

紫色桿菌素的生物合成分子機制研究已取得了重要進展，早期研究發(fā)現(xiàn)高色氨酸濃度對菌體有損害作用，認(rèn)為色素的合成與色氨酸的調(diào)控有關(guān)，通過研究色氨酸及吲哚衍生物對產(chǎn)紫色桿菌素的影響來推測其生物合成途徑.Momen等[3]通過同位素示蹤實驗確定了紫色桿菌素中所有C，H，N原子均來自色氨酸分子.紫色桿菌素合成相關(guān)的基因及生物合成途徑也已基本研究清楚.

2000年，C.volaceum 的生物合成基因簇克隆成功，長約9 kb[3].同時，August等[4]報道有4個基因（vio A，vio B，vio C，vio D）控制著紫色桿菌素的生物合成，但研究發(fā)現(xiàn)在E.coli 中表達這4個酶并不能將底物色氨酸轉(zhuǎn)變成紫色桿菌素.2003 年，C.volaceum（ATCC12472）全基因組測序完成.2006 年，Sánchez 等[5]發(fā)現(xiàn)了紫色桿菌素合成相關(guān)的第5個基因vio E，至此，紫色桿菌素的整個合成代謝途徑基本清楚.一個基因簇控制著整個紫色桿菌素的生物合成，長約7.3 kb，由5個基因組成（見圖1），這5個基因有相同的轉(zhuǎn)錄方向.這5個基因編碼紫色桿菌素合成相關(guān)的不同酶，根據(jù)這5種酶的催化順序及其功能，由色氨酸出發(fā)，在生物體內(nèi)經(jīng)過5步酶促反應(yīng)最終合成紫色桿菌素.紫色桿菌素及脫氧紫色桿菌素由于太不穩(wěn)定以至于不能很好地進行分離純化，因此，在5步酶促反應(yīng)后還有一個氧化脫羧的非酶促反應(yīng)過程，這2種產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成更穩(wěn)定的構(gòu)型.換言之，紫色桿菌素的整個生物合成途徑包括2個獨立的過程：一個是由5種蛋白酶vio ABCDE組成的酶催化過程；另一個是氧化脫羧的非酶催化過程.

圖1 紫色桿菌素基因簇結(jié)構(gòu)示意圖

2 基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵

目前所發(fā)現(xiàn)的合成紫色桿菌素菌種的產(chǎn)量均很低（亞馬遜河域菌株Chromobacterium violaceum 在最優(yōu)條件下的產(chǎn)量為0.43 g/L[6]），且培養(yǎng)條件較為苛刻，限制了紫色桿菌素的產(chǎn)業(yè)化推廣.近年來，紫色桿菌素合成的相關(guān)基因簇已經(jīng)基本研究清楚，因此構(gòu)建基因工程菌高效生產(chǎn)紫色桿菌素的研究正逐年增加.

1991 年，Pemberton等[7]從C.violaceum 中克隆紫色桿菌素生成合成基因簇，并將其在E.coli K12 中成功異源表達.有研究將pPSX-vio ABCDE轉(zhuǎn)化至E.coli K12 DH5α，傳至100代后質(zhì)粒仍保持穩(wěn)定性，但該工程菌生產(chǎn)紫色桿菌素水平較低.工程菌E.coli K12 DH5α PUC18-vio ABCDE 和Sphingomonas sp.JMP4092 pPSX-vioABCDE 合成紫色桿菌素能力雖然高，但質(zhì)粒不穩(wěn)定.為了構(gòu)建得到穩(wěn)定、高產(chǎn)的生產(chǎn)菌，Ahmetagic等[8]將pPSX-vioABCDE 轉(zhuǎn)化至E.coli K12系列宿主菌，發(fā)現(xiàn)E.coli K12 JM101，JM105和JM109不僅具有紫色桿菌素的高產(chǎn)特性，而且具有高產(chǎn)穩(wěn)定性.研究還發(fā)現(xiàn)，pPSX-vio ABCDE在啟動子區(qū)域缺失一個堿基對后發(fā)生變異，得到的pPSX-vio ABCDE opv-1可使E.coli K12 DH5α過量生產(chǎn)紫色桿菌素并具有高穩(wěn)定性.將高產(chǎn)菌株E.coli K12 JM109和高產(chǎn)質(zhì)粒pPSX-vio ABCDE opv-1組合構(gòu)建成一株穩(wěn)定高產(chǎn)紫色桿菌素的工程菌E.coli K12 JM109 pPSX-vio ABCDE opv-1.2011年，Ahmetagic等[9]研究了紫色桿菌素生物合成基因簇在E.coli K12中的表達情況，結(jié)果表明E.coli K12能夠合成紫色桿菌素，而且紫色桿菌素具有抑制E.coli的原生動物捕食特性.蔣培霞等[10]從新疆天山冰川土壤中分離出一株可合成紫色桿菌素的Dugane-lla sp.B2，通過對其紫色桿菌素生物合成基因簇進行分離、鑒定和克隆，并在不同的宿主如E.coli，Enterobacter aerogenes，Pseudomonas putida 和Citrobacter freundii 中進行表達，考察了基因工程菌生產(chǎn)紫色桿菌素的能力.研究發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的基因工程菌均能合成紫色桿菌素，但E.coli 合成色素的能力不如其他工程菌株.E.coli 在LB培養(yǎng)基中以色氨酸為底物，紫色桿菌素的產(chǎn)量最高達0.866 g/L.Pseudomonas putida 以色氨酸為底物，在LB 培養(yǎng)基中紫色桿菌素的產(chǎn)量達0.861 g/L，在E2 液體培養(yǎng)基中其色素產(chǎn)量可高達1.5 g/L.C.freundii 基因工程菌在初步優(yōu)化條件下，紫色桿菌素的產(chǎn)量達到1.68 g/L，且該工程菌具有生長快、易培養(yǎng)和生物合成穩(wěn)定性好等優(yōu)點.這一研究證明了紫色桿菌素可在基因工程菌中異源高效合成.

基因工程菌的構(gòu)建，除了功能基因或者基因簇的篩選，其表達質(zhì)粒與宿主的匹配性也至關(guān)重要，再通過密碼子優(yōu)化、啟動子工程等手段，能較好構(gòu)建獲得較強表達體系的工程菌株.

3 紫色桿菌素的生物活性

1942年，Lichstein等[11]發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素粗提物對革蘭氏陽性細菌具有顯著的抑制作用.此后，國內(nèi)外學(xué)者對紫色桿菌素的生物活性進行了大量研究和報道.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，紫色桿菌素具有多種生物活性，主要有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化4個方面的作用.

3.1 抗菌

Lichstein等[11]用51株細菌進行抗菌性實驗，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素的主要作用是抑制革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌的抑制效果并不明顯.Duran[12]發(fā)現(xiàn)，從巴西的Chromobacterium violaceum 純化到的紫色桿菌素也具有抗革蘭氏陽性菌活性.目前研究發(fā)現(xiàn)，紫色桿菌素可抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、芽孢桿菌、分枝桿菌[13]、奈瑟球菌、假單胞菌等，但對黃桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、黏質(zhì)沙雷菌、納豆芽孢桿菌、魏氏梭菌不具有抑制作用.體外實驗發(fā)現(xiàn)，高濃度（15 μg/mL）紫色桿菌素不僅抑制細菌生長，還能殺死細菌.紫色桿菌素抗結(jié)核分支桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為64 μg/mL和128 μg/mL.將紫色桿菌素制造成納米粒子聚合物能增加其溶解性，抑菌效果更好.Vio 納米粒子可以有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）ATCC29213 和ATCC 25923，最低抑菌濃度比純色素低2～5 倍.紫色桿菌素/聚己內(nèi)酯/殼聚糖納米粒子對S.aureus的最小抑菌濃度是25 μM，比單純色素的最小抑菌濃度要低.如今許多細菌具有耐藥性，而紫色桿菌素與其他常用抗生素組合用于抑制致病菌，具有協(xié)同效應(yīng)，抑菌作用更好.紫色桿菌素—慶大霉素和紫色桿菌素—頭孢羥氨芐組合使用，對S.aureus 的MIC是1.0 μg/mL，低于單純色素的MIC（5.7 μg/mL）.紫色桿菌素和大環(huán)內(nèi)酯物、氨基糖苷類抗生素組合使用的FICI低于0.5，表現(xiàn)出協(xié)同作用.紫色桿菌素與盤尼西林組合使用，對盤尼西林耐藥性的S.aureus 具有協(xié)同抑制作用，且二者組合使用的MIC比單獨使用的MIC要低得多.此外，紫色桿菌素還具有殺真菌特性，可以抑制植物真菌病原菌，如可導(dǎo)致桑樹根腐病的Rosellinia necatrix.

3.2 抗腫瘤

早期研究指出紫色桿菌素表現(xiàn)出抗腫瘤活性，可以抑制惡性細胞增殖，許多學(xué)者都在研究紫色桿菌素作為抗腫瘤藥物的潛能及其作用的機制[14].體外試驗發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素可以抑制MOLT-4 白血病細胞、NCIH460非小細胞性肺癌、KM12結(jié)腸癌細胞，GI50在0.03～0.06 μM范圍內(nèi)，而對多種淋巴瘤的抑制GI50為0.12～0.32 μM.Melo等[15]評估紫色桿菌素對V79成纖維細胞的細胞毒性時，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素對V79細胞具有高毒性，IC50為5～12 μM，且紫色桿菌素引發(fā)了V79細胞凋亡而不是壞死，細胞形態(tài)發(fā)生染色質(zhì)凝聚和核酸量減少.Saraiva 等[14]報道紫色桿菌素可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞92.1 和OCM-1，其IC50分別是2.78 μM 和3.69 μM.紫色桿菌素對白血病細胞有較好的抑制作用.Gimenez等[16]發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素對V79細胞的IC50是5 μM，對白血病細胞HL60的IC50是0.8 μM.同時，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素/β-環(huán)糊精復(fù)合物增強了對HL60細胞的毒性效應(yīng)，但對V79細胞毒性下降.當(dāng)紫色桿菌素與β-環(huán)糊精以1：2的比例形成絡(luò)合物時，可增加紫色桿菌素的溶解性，但對V79細胞的毒性低于相同濃度（1.2 μM）的純色素.通過研究紫色桿菌素誘使腫瘤細胞死亡的機制，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素對不同的腫瘤細胞會有不同的分子機制.紫色桿菌素通過介導(dǎo)活性氧簇物（ROS）的產(chǎn)生，引起人類結(jié)腸癌細胞Caco-2的凋亡，但在HT29細胞中不能增加ROS的產(chǎn)生，表明紫色桿菌素存在細胞類型特異性分子機制，同時也指出氧化壓力在紫色桿菌素的細胞毒性中起一定作用.Bromberg等[13]研究了紫色桿菌素對埃利希腹水瘤（EAT）的抑制作用，EAT細胞對紫色桿菌素的敏感度（IC50＝5.0 μM）是正常人外周血淋巴細胞的2倍.

3.3 抗病毒

May等[17]發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素可抑制侵染HeLa細胞的單純性皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）和脊髓灰質(zhì)炎病毒.當(dāng)紫色桿菌素混合物（含質(zhì)量濃度為10%的脫氧紫色桿菌素）的濃度為0.25 μg/mL和0.063 μg/mL時，可分別抑制62%的單純性皰疹病毒和56%的脊髓灰質(zhì)炎病毒；同時，還指出紫色桿菌素混合物具有更好的抗病毒活性.Andrighetti-Frohner等[18]研究指出紫色桿菌素對FRhK-4，Vero，MA104和Hep-2細胞的細胞毒性CC50在2.07～2.70 μM 的范圍.濃度在0.078～2.5 μM 的紫色桿菌素對阿昔洛韋耐藥性的HSV-1 病毒29-R、甲肝病毒（HN175 和HAF-203）和腺病毒5 型沒有細胞病變效應(yīng)或抗病毒活性，但濃度為0.312～1.250μM的紫色桿菌素對KOS和ATCC/VR-733 HSV病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒2型、猴輪狀病毒SA11有弱的抑制病毒復(fù)制作用.初步研究還顯示，紫色桿菌素脂質(zhì)體形式可增強對HSV-1的抵抗活性.

3.4 抗氧化

紫色桿菌素具有抗氧化活性，這可能與它的生物學(xué)功能有關(guān).Rettori等[19]得到了Chromobacerium violaceum 在10%和50%溶氧條件下的生長曲線，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素產(chǎn)量在細菌對數(shù)生長期有一個最高值，而且50%溶氧條件下的產(chǎn)量是10%溶氧條件下的3倍.當(dāng)有過氧化氫酶或抗壞血酸存在時，紫色桿菌素的生產(chǎn)會延遲2 h.這些結(jié)果表明，C.violaceum 生產(chǎn)紫色桿菌素作為抗氧化劑，以保護自身不受活性氧的氧化性損傷.Duran等[12]發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素/β-環(huán)糊精可以防止胃潰瘍發(fā)生，對HCl-乙醇引起的胃潰瘍抑制率達85%，推測紫色桿菌素的抗氧化活性可能增強了胃粘膜的防御機制，從而產(chǎn)生對胃潰瘍的抑制效應(yīng).當(dāng)紫色桿菌素和β-環(huán)糊精形成1：2的絡(luò)合物時，可增強紫色桿菌素的抗氧化活性，保護老鼠肝細胞免受過氧化損傷.質(zhì)量濃度為100 μM的紫色桿菌素和紫色桿菌素/β-環(huán)糊精絡(luò)合物，對紅細胞脂質(zhì)過氧化的抑制率分別為50%和80%，當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μM時，絡(luò)合物可完全抑制脂質(zhì)過氧化，而純紫色桿菌素只有65%的抑制率.

4 結(jié)語

由于紫色桿菌素具有多種生物活性功能，因而在許多方面具有應(yīng)用潛力，如在醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥等行業(yè)的應(yīng)用有待開發(fā).目前，紫色桿菌素作為藥物使用，關(guān)于其對正常細胞的毒性及可能出現(xiàn)的毒副作用方面的研究報道尚不多見，需要通過藥理實驗研究如何提高其生物活性，降低其細胞的毒性及副作用，使之發(fā)揮和其他藥物的協(xié)同療效.雖然紫色桿菌素的生物活性給予它很好的應(yīng)用前景，但由于微生物生產(chǎn)紫色桿菌素的產(chǎn)量仍然比較低，有關(guān)發(fā)酵生產(chǎn)工藝的研究較少；因此，我們應(yīng)加快紫色桿菌素的基因工程構(gòu)建、高產(chǎn)菌株篩選及生產(chǎn)工藝的深入研究.此外，目前大多數(shù)報道都是關(guān)于紫色桿菌素的研究，關(guān)于其副產(chǎn)物脫氧紫色桿菌素生物活性的研究則較少，已有報道指出脫氧紫色桿菌素可能在抗腫瘤活性中也能起一定作用.由此可見，對脫氧紫色桿菌素生物功能及特性的研究也非常有必要.

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