曬黃煙調(diào)制期葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究

夭建華，錢穎穎，陳建華，王毅，魏云林

倪紅梅1,2，李雪梅1，謝麗華1，米其利1，

1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明北市區(qū)紅錦路367號(hào) 650231;

2 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500

曬黃煙調(diào)制期葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究

夭建華1，錢穎穎1，陳建華1，王毅1，魏云林2

倪紅梅1,2，李雪梅1，謝麗華1，米其利1，

1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明北市區(qū)紅錦路367號(hào) 650231;

2 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500

以云南特色曬黃煙煙葉為供試樣品，對(duì)調(diào)制期三個(gè)部位煙葉定期取樣，研究葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化和多樣性。結(jié)果表明，曬黃煙調(diào)制期葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量呈先升高后降低再略升高的趨勢(shì)。細(xì)菌種群較為豐富，主要分布在Bacillus屬、Pseudomonas屬、Arthrobacter屬和Exiguobacterium屬等10個(gè)屬。Bacillus屬菌株是整個(gè)調(diào)制期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，與烤煙煙葉的優(yōu)勢(shì)種群基本一致。

曬黃煙；煙葉調(diào)制；可培養(yǎng)細(xì)菌；動(dòng)態(tài)變化；多樣性

曬黃煙是我國特有的一種煙葉類型，在我國已有幾百年的栽培歷史[1]。與烤煙相比，曬黃煙具有獨(dú)特的煙葉品質(zhì)，能滿足卷煙品牌對(duì)原料多樣化的需求[2-6]。云南曬黃煙是我國重要的晾曬煙品種資源，屬于淡色曬黃煙，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和人工栽培，形成了獨(dú)特的香型和品質(zhì)，除可做混合型卷煙原料外，還可兼做烤煙型卷煙原料[2]。煙葉微生物在煙葉調(diào)制和發(fā)酵過程中起著重要作用，這些微生物隨調(diào)制方式和發(fā)酵條件的變化而發(fā)生變化，對(duì)煙葉產(chǎn)品的形成及其品質(zhì)產(chǎn)生了不同的作用[7-15]。關(guān)于曬黃煙煙葉微生物的研究，僅見周燕等將從湖南寧鄉(xiāng)曬黃煙植株中分離的內(nèi)生菌用于煙草青枯病的防治[16]，云南曬黃煙煙葉微生物的研究尚未見報(bào)道。本文以云南曬黃煙煙葉為材料，分析了煙葉調(diào)制過程中葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行了序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和優(yōu)勢(shì)菌群分析，為微生物在曬黃煙煙葉人工調(diào)控調(diào)制過程中提升煙葉品質(zhì)的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白大豆培養(yǎng)基（美國BD公司）；兩性霉素B（Sigma公司）；磷酸緩沖液（pH7.0-7.2，HyClone公司）。

超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司）；電子天平（感量0.1mg,Mettler Toledo ΧS204）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（廣州永程公司）；恒溫水浴搖床（德國VIVO公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒公司）；自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（杭州迅數(shù)公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（日本ALP公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙葉調(diào)制和取樣

煙葉樣品取自曬黃煙品種云曬1號(hào)，種植于云南盈江縣弄璋曬黃煙基地。將新鮮煙葉采收、編桿后置于晾曬棚內(nèi)進(jìn)行自然曬制，晾曬棚所在地地勢(shì)平坦、通風(fēng)向陽、干燥，棚成屋脊形，4周蓋上塑料膜。

2013年3月至4月期間，從新鮮煙葉采收到煙葉調(diào)制結(jié)束，分別收集下、中、上3個(gè)部位的煙葉，每3天取樣一次，將收集的煙葉樣品放置于無菌采樣袋中，4℃保存?zhèn)溆茫▋?chǔ)存時(shí)間不超過5 d）。

1.2.2 細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

煙葉菌懸液的制備參照張成省等[17]，略有改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取煙葉5g，放入盛有95mL無菌磷酸緩沖液的三角瓶?jī)?nèi)，置于恒溫培養(yǎng)搖床中室溫160rpm震蕩30min后，用雙層無菌紗布過濾后收集濾液，并用無菌磷酸緩沖液將濾液梯度稀釋，制成菌懸液，備用。

葉面細(xì)菌的分離使用胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基，采用稀釋涂布平板法進(jìn)行，每個(gè)濃度的菌懸液做三皿平行。細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后，觀察并計(jì)數(shù)每皿的菌落數(shù)，菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，cfu）表示，菌落的觀察、計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)和菌落總數(shù)的計(jì)算方法按照GB 4789.2-2010進(jìn)行[18]。

參照李文建[19]和顏艷偉等[20]，根據(jù)菌落的形態(tài)學(xué)特征對(duì)菌株進(jìn)行歸類和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，以確定優(yōu)勢(shì)菌群。優(yōu)勢(shì)菌群定義：在最高稀釋度上，菌落數(shù)占總菌落數(shù)的比例為10%以上。

1.2.3 細(xì)菌的純化、鑒定和序列分析

根據(jù)菌落的形態(tài)學(xué)特征分離細(xì)菌，每個(gè)種類挑取3個(gè)至胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基上；培養(yǎng)后，將細(xì)菌在固體平板劃線、培養(yǎng)，并挑取單菌落接種至胰蛋白大豆液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，并再次在固體平板上劃線、培養(yǎng)，直至獲得純的菌株。將分離到的細(xì)菌在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，根據(jù)形態(tài)學(xué)差異將其分為不同類群，每個(gè)類群挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行16S rRNA序列的測(cè)定，送至深圳華大基因科技有限公司完成。測(cè)序所用的通用引物是20F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和 1500R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’)[21]。 細(xì) 菌 的 16S rRNA序列經(jīng)過校正后，在國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/） 中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行細(xì)菌的16S rRNA序列同源性比對(duì)時(shí)，下載相關(guān)模式菌株的16S rRNA序列，利用Clustal Χ軟件對(duì)16S rRNA序列與模式菌株的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，然后用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建Neighbor-Joining分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行1000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)[22-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面細(xì)菌總量的變化

調(diào)制期間，云曬1號(hào)葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示，不同部位的鮮煙葉（收集時(shí)間為第1天），細(xì)菌總量基本一致（3.30×103～8.60×103）cfu/g；晾制第4天，下部葉和中部葉兩個(gè)部位煙葉的細(xì)菌總量均達(dá)到最大；至晾制第7天，上部葉細(xì)菌總量達(dá)到最大；其后，細(xì)菌總量明顯下降，調(diào)制后期至調(diào)制結(jié)束時(shí)，細(xì)菌總量略有升高。調(diào)制期間，3個(gè)部位煙葉葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量的變化趨勢(shì)較為接近，均呈先升高后降低再略升高的趨勢(shì)。中部葉和上部葉兩個(gè)部位葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量變化的趨勢(shì)較為平緩；下部葉葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量變化顯著，主要表現(xiàn)在晾制前中期（第4天），細(xì)菌總量上升約40倍，由初始的5.40×103cfu/g升至2.30×105cfu/g。下部葉的細(xì)菌數(shù)量總體上明顯高于中部葉和上部葉，推測(cè)可能是由于下部葉離地距離較近，易受土壤微生物的污染，另外下部葉通風(fēng)透氣性較差，空氣微生物易沉降在下部煙葉表面。

表1 調(diào)制期間煙葉可培養(yǎng)細(xì)菌的總量Tab.1 Total amount of cultivable bacteria on tobacco leaves during tobacco processing cfu/g

2.2 細(xì)菌鑒定和多樣性分析

自曬黃煙下、中、上三個(gè)部位煙葉表面分離到247株細(xì)菌，根據(jù)顯微鏡觀察到的形態(tài)學(xué)差異將其分為61個(gè)類群，每個(gè)類群挑取1株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因序列分析，獲得45株細(xì)菌的16S rRNA基因序列。將測(cè)序得到的序列在國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中進(jìn)行同源性比對(duì)。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明，調(diào)制期曬黃煙3個(gè)部位煙葉葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的種群較為豐富，主要分布在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、γ-變形菌綱細(xì)菌（Gamma proteobacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、泛菌屬（Pantoea）等10個(gè)屬。其中，分離到的Bacillus屬菌株較多，有短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等。

在NCBI GenBank上進(jìn)行同源性搜索，得到所測(cè)菌株相近種或模式種的16S rRNA序列，利用Clustal Χ軟件對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建曬黃煙葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，將Halobacterium salinarum作為外群，見圖1。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，曬黃煙葉面可培養(yǎng)細(xì)菌中芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌形成一較大的進(jìn)化分枝，提示Bacillus屬類群在曬黃煙煙葉調(diào)制過程中可能發(fā)揮著重要作用。

圖1 曬黃煙葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of cultrable bacteria on tobacco leaves

2.3 調(diào)制期葉面細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群的變化

整個(gè)晾制期間，自云曬1號(hào)煙葉分離到的Bacillus屬菌株數(shù)量最多，其次是Brevibacillus、Arthrobacter和Enterobacter屬菌株，其他屬的菌株相對(duì)較少。不同部位煙葉在調(diào)制期間的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群略有差異，總體上以Bacillus屬菌株為主。對(duì)于新鮮的下部葉，Enterobacter屬和Bacillus屬菌株較多，其后至調(diào)制結(jié)束，基本以Bacillus屬菌株為主，其次是Brevibacillus屬菌株。對(duì)于中部葉，整體以Bacillus屬菌株為主，新鮮煙葉和晾制第7天分別存在相對(duì)較多的Arthrobacter屬和Enterobacter屬菌株。上部鮮煙葉分離到的菌株情況基本與下部鮮煙葉相同，以Enterobacter屬和Bacillus屬菌株為主，其后雖有相對(duì)較多的Pantoea屬菌株，仍以Bacillus屬菌株為主。

表2 云曬1號(hào)調(diào)制期間細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群的變化Tab.2 Dynamics of cultivable bacteria on tobacco leaves during tobacco processing

3 結(jié)論與討論

煙草調(diào)制期，在煙葉緩慢失水過程中發(fā)生著復(fù)雜的物理和化學(xué)變化。煙葉微生物對(duì)煙草調(diào)制可產(chǎn)生復(fù)雜的作用，例如引起調(diào)制期煙葉腐爛變質(zhì)，煙草特有亞硝胺（tobacco-speci fi c nitrosamine，TSNA）的積累[25]，促進(jìn)煙葉香氣的產(chǎn)生[26]等。煙葉表面微生物有霉菌、細(xì)菌、放線菌等，其中細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[7,27]。

本文首次對(duì)我國特色煙葉云南曬黃煙晾制期間葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化和多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，云曬1號(hào)煙葉調(diào)制期間，煙葉表面細(xì)菌種群較為豐富，主要分布在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）等10個(gè)屬。其中分離到的Bacillus屬菌株數(shù)量最多，是整個(gè)晾制期間的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，其 次 是Brevibacillus屬、Arthrobacter屬 和Enterobacter屬菌株，其他屬的菌株相對(duì)較少。云曬1號(hào)煙葉上的主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群與烤煙煙葉的優(yōu)勢(shì)種群基本一致，而與白肋煙的不同。在烤煙的自然醇化和人工發(fā)酵期間，Bacillus屬菌株是主要的優(yōu)勢(shì)種群之一[7,9,10,14,25,27,28]。白肋煙調(diào)制期間，Pseudomonas屬菌株是主要的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群之一，優(yōu)勢(shì)種群中未見Bacillus屬菌株[28-31]。早在1967年English等發(fā)現(xiàn)分離自闊葉煙的Bacillus屬菌株能夠促進(jìn)煙葉香氣的產(chǎn)生[26]；Bacillus屬菌株分別被Fravel等、Lian等和Huang等用于煙草赤斑病、煙草花葉病毒和煙草灰霉病的防治[32-34]；雷麗萍將Bacillussp.WT處理白肋煙，可降低煙葉TSNA含量[35]。由此推測(cè)，Bacillus屬菌株在曬黃煙調(diào)制期可能對(duì)煙葉香氣產(chǎn)生、病菌防治以及TSNA形成等發(fā)揮著一定的作用。

云曬1號(hào)葉面細(xì)菌總量的變化趨勢(shì)與烤煙和白肋煙的有所不同?？緹熀婵具^程中，細(xì)菌數(shù)量呈先升高后明顯下降的趨勢(shì)[29]；白肋煙調(diào)制過程中，細(xì)菌總量呈逐漸降低的趨勢(shì)[28]。而云南曬黃煙葉面細(xì)菌總量呈先升高后降低再略升高的趨勢(shì)。這可能與三種煙草的調(diào)制方式（主要是葉片失水情況、環(huán)境溫度和濕度）不同有關(guān)。在調(diào)制結(jié)束時(shí)，曬黃煙葉面仍有一定數(shù)量的細(xì)菌存在，提示葉面細(xì)菌的生命活動(dòng)對(duì)曬黃煙的發(fā)酵品質(zhì)也可能產(chǎn)生影響。

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Diversity analysis of cultivable bacteria on leaf surface of yellow sun-cured tobacco during curing

NI Hongmei1,2,LI Xuemei1,XIE Lihua1,MI Qili1,YAO Jianhua1,QIAN Yingying1,CHEN Jianhua1,WANG Yi1,WEI Yunlin2
1 Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd,Kunming 650231,China;
2 School of Life Science and Biotechnology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China

Samples of Yunnan yellow sun-cured tobacco leaves were collected during sun-curing.Dynamics and diversity of cultivable bacterial community were investigated.Results showed that total amount of bacteria fi rstly increased,then decreased,and fi nally increased slightly.Bacterial species were relatively rich.About ten genera of bacteria were identi fi ed,includingBacillus,Pseudomonas,Arthrobacter,Exiguobacteriumetc.Bacillusspp.were the dominant bacteria during sun-curing and also the dominant populations on fl ue-cured tobacco leaves.

yellow sun-cured tobacco; curing; cultivable bacteria; dynamic change; diversity

倪紅梅，李雪梅，謝麗華，等.曬黃煙調(diào)制期葉面可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2015,21（1）

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目（2013YL01）

倪紅梅（1976—），在讀碩士，研究方向：微生物學(xué)，Email：kunminghmni@126.com

米其利（1981—），在讀博士，主要從事煙草生物技術(shù)研究，Email：miqiliyn@126.com

魏云林（1969—），博士，教授，Email：homework18@126.com

2014-05-19

：NI Hongmei,LI Χuemei,ΧIE Lihua,et al.Diversity analysis of cultivable bacteria on leaf surface of yellow sun-cured tobacco during curing [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(1)