甲硫醚降解菌JLM-8的分離鑒定與降解條件優(yōu)化

邱吉國，李愛文，葉杰旭，陳建孟

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甲硫醚降解菌JLM-8的分離鑒定與降解條件優(yōu)化

邱吉國，李愛文，葉杰旭，陳建孟

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310014）

從制藥廠的活性污泥中分離到一株能以唯一碳源和硫源降解甲硫醚的菌株JLM-8，經(jīng)過生理生化測試與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（）。通過測定菌株的生長量、甲硫醚的降解率，利用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳降解條件，并測定了該菌降解甲硫醚的動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：當(dāng)接種量為25 mg·L-1時，通過響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳降解條件為溫度31.3℃、pH 7.5，初始甲硫醚濃度50 mg·L-1時最大預(yù)測降解率為98.2%，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證降解率為97.9%。菌株降解動力學(xué)參數(shù)最大比降解速率、半飽和系數(shù)抑制系數(shù)分別為2.37 h-1、143.55 mg·L-1、51.35 mg·L-1，臨界抑制濃度為78.46 mg·L-1。

甲硫醚；嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌；降解；動力學(xué)；環(huán)境

引 言

隨著我國化工、石化、輕工等工業(yè)的迅速發(fā)展，大量揮發(fā)性有機(jī)硫化物（volatile organic sulfur compounds，VOSCs）被隨意排放進(jìn)入大氣中，其中甲硫醚（dimethyl sulfide，DMS）是主要的有機(jī)硫化物。同大多數(shù)VOSCs一樣，DMS是惡臭氣體，嗅閾值較低[(0.07～5.9)×10-3μl·L-1][1-2]，且其具有生物毒性和腐蝕性，當(dāng)空氣中的濃度高于0.5 μl·L-1時就可對身體健康產(chǎn)生危害[3]。DMS這一惡臭氣體的存在嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，給人類的健康帶來極大的危害[4-5]。在工業(yè)生產(chǎn)中，DMS是低碳硫醚系列的主要品種之一，是重要的化工原料和中間體，可以合成多種農(nóng)藥殺蟲劑、殺菌劑，在合成農(nóng)藥領(lǐng)域占有重要地位。因此采用高效經(jīng)濟(jì)的方法來處理DMS是一項(xiàng)意義重大的舉措[6]。國內(nèi)外有不少的學(xué)者采用化學(xué)法、物理法來處理DMS[7]，但是這些方法都存在一定的缺陷和不足，這些方法需要較高的成本和能量供應(yīng)，并會產(chǎn)生二次污染，因此，化學(xué)、物理的方法不是經(jīng)濟(jì)有效的處理方法。相比之下，生物法處理惡臭氣體既環(huán)保又經(jīng)濟(jì)，尤其對那些低濃度高通量的惡臭氣體的去除更加有效[8-10]。

當(dāng)前大部分報(bào)道的降解菌株都能利用DMS為唯一碳源和能源生長，如Suylen等[11]從造紙廠生物過濾器中篩選到的sp. EG。Sch?fer[12]從英吉利海峽的海水中篩選的sp. DMS026。少部分細(xì)菌則只能以共代謝的方式降解DMS，如ATCC 19178a[13]和NI[14]。另外，不動桿菌sp. 20B能利用DMS為硫源生長[15]。在厭氧條件下，一些產(chǎn)甲烷古菌如和等可以利用硝酸鹽作為電子受體厭氧轉(zhuǎn)化DMS[3]。這些不同的降解方式顯示了微生物代謝DMS的生物多樣性。研究結(jié)果顯示，DMS降解菌雖分布較廣，但DMS降解能力較弱[16-17]。因此，為提高環(huán)境中DMS的降解效率，進(jìn)一步篩選高效降解DMS的菌種，并研究其生物降解特性就具有重要的意義[18]。

在本文的研究中，從活性污泥中分離得到了一株DMS的高效降解菌嗜芽單胞菌JLM-8，采用響應(yīng)面分析的方法[19]優(yōu)化菌株的降解條件，用動力學(xué)模型分析底物的降解情況以及菌體的生長情況，為生物法處理DMS污染物奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

甲硫醚購自上海百靈威科技公司。其他常規(guī)試劑購自杭州常青化工公司。

基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM，g·L-1）：Na2HPO4·12H2O 4.5，KH2PO41.0，NH4Cl 1.5，MgCl20.2，CaCl20.023，微量元素母液1 ml。微量元素母液（g·L-1）：FeCl21.0，H3BO30.014， MnCl20.10，ZnCl20.10，Na2MoO4·2H2O 0.02，CoCl2·6H2O 0.02。

LB培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 10。

1.2 降解菌株的分離鑒定

活性污泥取自浙江臺州某醫(yī)藥廠污水池。將污泥放置廣口瓶中，以DMS為唯一碳源和能源進(jìn)行馴化、富集。數(shù)月后取上層菌懸液，接種至含50 ml MSM培養(yǎng)基的250 ml密封藍(lán)蓋瓶中，以DMS作為唯一碳源和能源，30℃、180 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)。將在藍(lán)蓋瓶中經(jīng)過多次傳代富集的混合菌液進(jìn)行稀釋涂布，依據(jù)菌體群落的差異性挑取單菌落，進(jìn)行多次劃線分離后，再接種至以DMS為唯一碳源和能源的MM培養(yǎng)基中，驗(yàn)證其是否具有DMS降解能力。選擇具有DMS降解能力的純菌，低溫保藏。除觀察菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡等設(shè)備檢測并記錄菌體的個體形態(tài)特征，并進(jìn)一步用JEOLJEM- 1200EX透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

常規(guī)生理生化方法按照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行。16S rDNA序列分析：以菌株基因組DNA為模板，以16S rDNA通用引物（27F和1492R）擴(kuò)增全長的16S rDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程公司測序后，所得DNA序列在GenBank進(jìn)行BLAST，對獲得的同源序列進(jìn)行分析，用ClusterX4.0進(jìn)行序列分析，采用Mega5.0鄰位相連法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3 菌體培養(yǎng)

從斜面中將菌種轉(zhuǎn)接至裝100 ml LB培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，置于30℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h，離心收集菌體（4℃、9000 r·min-1、10 min），并用磷酸緩沖液（50 mmol·L-1、pH 8.0）沖洗2次，得到降解用靜息細(xì)胞，再加入適量液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配制成靜息細(xì)胞懸濁液。

1.4 DMS的降解實(shí)驗(yàn)

在測定菌株利用DMS的生長情況時，使菌種接種量在5 mg·L-1。在培養(yǎng)條件優(yōu)化及放大培養(yǎng)中，控制培養(yǎng)液初始生物量為25 mg·L-1進(jìn)行降解。DMS初始濃度為50 mg·L-1，于30℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)。同時設(shè)未接種的對照組。定期取樣測定菌體生長和DMS的殘留情況。細(xì)菌的生長情況通過單位體積的生物量（干重）的值來進(jìn)行檢測，剩余的DMS的量通過GC來測量。在相同的條件下，菌株JLM-8對DMS降解動力學(xué)分析采用不同的起始濃度（25、50、100、150、200、250和300 mg·L-1）。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化DMS降解條件

利用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株JLM-8對DMS的最佳降解條件。采用Design-Expert（version 8.0.6）軟件，依據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以溫度、pH和降解菌株初始接種量3個反應(yīng)條件為自變量，以DMS的降解率（%）為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，因素和水平值見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及對應(yīng)值

1.6 DMS的降解動力學(xué)模型

依據(jù)式（1）計(jì)算底物DMS的不同起始濃度與菌株JLM-8的比降解速率

式中，為比降解速率，h-1；為底物濃度，mg·L-1；為反應(yīng)時間，h。

菌株JLM-8的比生長速率依據(jù)Haldane’s模型進(jìn)行計(jì)算[21-22]，其方程如下

式中，max為最大比降解速率，h-1；s為半飽和系數(shù)，mg·L-1；i為抑制常數(shù)，mg·L-1。

1.7 分析方法

DMS通過帶有FPD檢測器的安捷倫氣相色譜（HP-Innowax 硅膠毛細(xì)管柱，30 m×0.32 mm×0.5 μm，J&W Scientific，USA）測定，方法為：H2和空氣流速50 ml·min-1，載氣為N2，流速為200 ml·min-1，進(jìn)樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為180、100、180℃。每個樣品進(jìn)樣量為200 μl。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 降解菌的分離和鑒定

經(jīng)過馴化、富集、稀釋涂布、挑取單菌落等一系列步驟后，根據(jù)菌體群落形態(tài)的差異，篩選出一株菌體能高效降解DMS，將其命名為JLM-8。菌株JLM-8利用無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的DMS作為唯一的C源和S源，10 h內(nèi)能將50 mg·L-1的DMS降解完全。菌株革蘭染色呈陰性，桿狀，大小為（0.2～0.5）μm×（1.2～1.7）μm，無芽孢，平板上菌落呈小圓狀、白色、形態(tài)飽滿、光滑濕潤，易挑起，菌苔沿劃線生長。V-P試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)呈陽性，吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、精氨酸雙水解試驗(yàn)、熒光色素試驗(yàn)呈陰性。菌株能利用麥芽糖、檸檬酸和蘋果酸生長，不能利用甘露糖和乳酸。該菌對紅霉素和四環(huán)素有耐藥性，對于青霉素、氯霉素和慶大霉素敏感。以菌株的基因組DNA為模板PCR獲得 約1400 bp的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物（GenBank：KP979740）。通過BLAST發(fā)現(xiàn)該菌16s rDNA序列與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌模式菌株B6（GenBank：JQ579644）和.D457（GenBank：HE798556）的相似度分別為100%和99.4%。JLM-8的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。根據(jù)菌株生理生化特性與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將JLM-8鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（）。迄今為止，尚未有嗜麥芽單胞菌屬（spp.）的菌株具有DMS降解能力的報(bào)道。

圖1 JLM-8與Stenotrophomonas屬中典型菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株JLM-8利用DMS的生長特性

菌株JLM-8在MSM中以DMS為唯一碳源、硫源的降解過程及菌體的生長曲線如圖2所示。在接種后的2～8 h，底物DMS的降解速率最大，約90%。經(jīng)過10 h后，DMS降解率接近100%。菌株JLM-8降解DMS的速率為6.25 mg·L-1·h-1，優(yōu)于已報(bào)道的兩株細(xì)菌sp. 20B（5.65 mg·L-1·h-1）[15]和DS1（5.9 mg·L-1·h-1）[23]。經(jīng)過約4 h的延滯期，菌體生長迅速增加，最終濃度達(dá)到26 mg·L-1。菌體在DMS降解完后繼續(xù)生長可能是降解中間產(chǎn)物沒有完全降解，JLM-8能利用中間產(chǎn)物繼續(xù)生長。

2.3 菌株JLM-8降解DMS的最佳降解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定溫度在25～35℃之間，初始pH范圍在5.0～9.0之間，接種量在5～45mg·L-1之間，以DMS降解率為響應(yīng)值，經(jīng)軟件Design Expert V8.0.7設(shè)計(jì)出響應(yīng)面分析S試驗(yàn)，結(jié)果見表2。用Design Expert對試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）中的DMS降解率的試驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，可以得出各影響因子對響應(yīng)值的影響，得到二次多項(xiàng)式方程如下

圖2 菌株JLM-8對DMS的降解曲線及生長曲線

表2 實(shí)驗(yàn)方案與實(shí)際和預(yù)測響應(yīng)值

式中，代表去除率，、、分別代表溫度、pH和接種量。

本試驗(yàn)所擬合的模型的顯著系數(shù)＜0.0001，該模型具有極高的顯著性，建立的模型具有較高的可靠性。在考察的幾個因素中，-溫度、-pH、2、2、2的值均小于0.01，說明這幾項(xiàng)對去除率的影響極顯著；而-接種量值大于0.05，說明對去除率的影響不顯著，可能是由于所選接種濃度超過對降解產(chǎn)生影響的變化閾值。在本回歸模型中，失擬指數(shù)0.0544＞0.05，表明該二次方程失真不顯著，因此可以進(jìn)一步分析。

當(dāng)接種量為25 mg·L-1時，最佳降解條件為溫度31.3℃、pH7.5，最大預(yù)測降解率為98.2%。為了驗(yàn)證上述模型準(zhǔn)確性，按上述條件進(jìn)行了試驗(yàn)，得出的降解率數(shù)據(jù)為97.9%，這與預(yù)測值十分接近，表明該模型能很好地預(yù)測降解情況。

2.4 DMS起始濃度對菌株JLM-8降解的影響

不同DMS起始濃度下，菌株降解速率也不同。起始濃度為25、50、100 mg·L-1時，8 h內(nèi)的降解率為100%。當(dāng)濃度為150、200、250和300 mg·L-1，12 h的降解率分別為90%、85%、82.3%、75%。雖然菌株JLM-8是降解DMS的特定菌株，但在DMS降解過程中，由于其本身對微生物有一定的毒害作用，因此當(dāng)濃度達(dá)到一定值時，會對降解過程產(chǎn)生抑制效應(yīng)。為了定量描述這種抑制效應(yīng)，采用Haldane’s模型對菌株降解過程進(jìn)行動力學(xué)擬合，如圖3所示。菌株JLM-8降解DMS的比降解動力學(xué)參數(shù)：max2.37 h-1、s143.55 mg·L-1、i51.35 mg·L-1。所得相關(guān)系數(shù)20.996說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測吻合度高。DMS臨界抑制濃度為78.46 mg·L-1（圖3），當(dāng)DMS起始濃度低于此濃度時比降解速率隨濃度增加而逐漸增加，當(dāng)大于該值時，比降解速率逐漸降低，說明底物對降解的抑制作用越顯著。

圖3 菌株JLM-8降解DMS的起始濃度與比降解速率的Haldane’s模型擬合

3 結(jié) 論

本文分離到一株可以降解DMS的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，研究了不同條件下該菌株的降解特性，主要結(jié)論如下。

（1）根據(jù)菌株生理生化特性與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將JLM-8鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。本研究是迄今為止首次報(bào)道嗜麥芽單胞菌屬（spp.）的菌株具有DMS降解 能力。

（2）考察了溫度、初始pH和接種量三單因素下DMS降解率，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳降解條件：溫度31.3℃、pH7.5，接種量為25 mg·L-1，最大預(yù)測降解率為98.2%，試驗(yàn)驗(yàn)證降解率數(shù)據(jù)為97.9%，表明該模型能很好地預(yù)測降解情況。

（3）通過測定不同DMS起始濃度的降解速率，根據(jù)Haldane’s模型擬合菌株降解動力學(xué)參數(shù)：max2.37 h-1、s143.55 mg·L-1、i51.35 mg·L-1，相關(guān)系數(shù)20.996。證明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測吻合度高。

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Isolation and characterization of a novel dimethyl sulfide degrading strainJLM-8

QIU Jiguo, LI Aiwen, YE Jiexu, CHEN Jianmeng

College of Biological and Environmental EngineeringZhejiang University of TechnologyHangzhouZhejiangChina

Dimethyl sulfide (DMS) is one of the most important volatile organic sulfur compounds. Due to its malodorous smell and the extremely low odor threshold, DMS has become a critical issue in wastewater collection and treatment systems. In this study, a novel strain JLM-8, with capability of degrading DMS as sole carbon and sulfur source, was isolated from the active sludge of a pharmaceutical plant. Based on the morphological, physiological and biochemical properties as well as its 16S rDNA gene sequence analysis, the strain JLM-8 was identified as a member of. The strain could degrade approximately 100% of 50 mg·L-1DMS within 8 hours at pH 7 and 30℃. Response surface methodology (RSM) analysis showed that the optimum conditions for degradation were at pH 7.5 and 31.3℃, using an inoculum amount of 25 mg·L-1. Under these conditions, approximately 97.9% of DMS was degraded. The kinetic parametersmax,s, andiwere established to be 2.37 h-1, 143.55 mg·L-1, 51.35 mg·L-1, respectively. The critical inhibitor concentration was determined to be 78.46 mg·L-1.Research on the characterization of DMS degradable bacteria can provide a new theoretical and technical fundamental basis for bioremediation of DMS-contaminated environments.

dimethyl sulfide;; degradation; kinetics; environment

2015-05-29.

Prof.CHEN Jianmeng, jchen@zjut.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150746

Q 939.9

A

0438—1157（2015）08—3242—06

陳建孟。

邱吉國（1984—），男，博士，助理研究員。

中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014M560495）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201329224）；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”（IRT13096）。

2015-05-29收到初稿，2015-06-06收到修改稿。

supported by the China Postdoctoral Science Foundation (2014M560495), the Program of the Department of Education of Zhejiang Province (Y201329224) and the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (IRT13096).