不同產(chǎn)地通關(guān)藤藥材有機(jī)酸HPLC－ELSD 指紋圖譜

□張阿琴 劉世平 李邇娜

通關(guān)藤又名通光散、烏骨藤、雙合藤、奶漿藤等，以蘿藦科牛奶菜屬通關(guān)藤的干燥藤莖入藥。全年可采，刮去外層栓皮，切片曬干。始載于《滇南本草》，收載于《中華本草》、《中藥大辭典》及2010 版《中國藥典》。具有清熱解毒，止咳平喘，治肺炎，支氣管炎，支氣管哮喘，咽喉炎，扁桃體炎，膀胱炎，療瘡腫毒等多種療效。

雖然國內(nèi)已經(jīng)有一些文獻(xiàn)資料是關(guān)于通關(guān)藤藥材及制劑指紋圖譜研究的，但卻局限于在單一產(chǎn)地的通關(guān)藤藥材化學(xué)成分的研究。因藥材產(chǎn)地、藥用部位、藥材真?zhèn)蔚纫蛩赜绊?，尚無較完整的通關(guān)藤藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步采用HPLC 法聯(lián)合ELSD 檢測(cè)器對(duì)11 個(gè)不同產(chǎn)地通關(guān)藤藥材質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究，建立了通關(guān)藤的有機(jī)酸指紋圖譜，對(duì)于確保該藥材的質(zhì)量穩(wěn)定十分重要。

一、儀器

Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀:包括二元梯度泵(G1312A)、在線真空脫氣機(jī)(G1322A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329A)、柱溫箱(G1316A)、HP Chem Station 化學(xué)工作站;Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;Mettler Toledo電子天平(XS105DU)。

二、材料

共11 個(gè)樣品，其中大理市賓川縣、云南省麗江市、云南省楚雄自治州、貴州省安順市為購買的樣品，其余采自產(chǎn)地(南京中醫(yī)藥大學(xué)谷巍教授鑒定為正品)。

乙腈(色譜純);水(樂百氏純凈水);甲酸(色譜純);甲醇(分析純)。

三、方法

(一)色譜條件。Agilent ZORBAX SB－ C18 柱(4.6 ×250mm，5μm);流動(dòng)相為A 與B 的混合溶液，A－0.05%磷酸溶液，B－0.05%磷酸乙腈溶液，按表1 進(jìn)行梯度洗脫。

表1

平衡時(shí)間10min;流速1mL·min－1;檢測(cè)波長300nm;進(jìn)樣量20μL;柱溫25℃。

(二)溶液配制。

1.對(duì)照品溶液的配制。精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，用50% 甲醇溶解，制成20μg/ml 的溶液，得對(duì)照品溶液。

2.供試品溶液的配制。取適量藥材，粉碎后過四號(hào)篩，取粉末2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25ml，密塞，稱定重量，浸泡放置24 小時(shí)，置水浴中加熱回流2 小時(shí)，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

(三)精密度試驗(yàn)。分別吸取供試品溶液(2 號(hào))20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6 次，考察圖譜上色譜峰保留時(shí)間是否一致，以峰面積計(jì)算，RSD 為1.20%，說明精密度較好，所測(cè)得的指紋圖譜與共有模式圖譜相似度分別為0.9998、0.9993、0.9995、0.9995、0.9997、0.9998，符合指紋圖譜要求。

(四)穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別吸取(三)項(xiàng)下供試品溶液20μL 在0，2，4，8，16，24 h 進(jìn)樣，考察穩(wěn)定性，RSD 為2.16%，說明樣品溶液24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，指紋圖譜與共有模式圖譜相似度分別為0.9991、0.9993、0.9995、0.9987、0.9983、0.9975，符合指紋圖譜要求。

(五)重復(fù)性試驗(yàn)。分別取(三)項(xiàng)下供試品溶液20μL，連續(xù)測(cè)定6 次，考察重復(fù)性，RSD 為1.28%，說明重復(fù)性較好。指紋圖譜與共有模式圖譜相似度分別為0.9987、0.9983、0.9985、0.9997、0.9992、0.9993，符合指紋圖譜要求。

(六)通關(guān)藤有機(jī)酸HPLC—ELSD 指紋圖譜的生成及分析。依據(jù)11 個(gè)不同來源的通關(guān)藤藥材的檢測(cè)結(jié)果，利用藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”，自動(dòng)產(chǎn)生通關(guān)藤藥材指紋圖譜的對(duì)照模式(圖1)，該圖譜中共有13 個(gè)色譜峰，通過對(duì)照保留時(shí)間，指認(rèn)了7 號(hào)峰為綠原酸。

測(cè)定各產(chǎn)地通關(guān)藤藥材樣品的指紋圖譜(圖1)，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A 版”軟件對(duì)從各產(chǎn)地藥材指紋圖譜進(jìn)行處理，所得結(jié)果見表1，其中1～7 號(hào)樣品相似品較高(≥0.8)，8～11 號(hào)樣品的相似度較低(＜0.8)，體現(xiàn)出產(chǎn)地對(duì)藥材質(zhì)量的影響。

圖1 11 批不同產(chǎn)地通關(guān)藤藥材指紋圖譜

A.共有模式;B.通關(guān)藤藥材A 中:7(s)號(hào)峰為綠原酸

表2 不同產(chǎn)地通關(guān)藤有機(jī)酸類成分指紋圖譜相似度

四、討論

本試驗(yàn)首次對(duì)不同產(chǎn)地通關(guān)藤藥材有機(jī)酸HPLC－ELSD 指紋圖譜進(jìn)行了比較和分析，11 批不同產(chǎn)地的藥材中，云南金平、云南思茅相似度較高(＞0.9)，云南賓州、云南楚雄、云南麗江、云南臨滄、云南六庫的藥材相似度較高(＞0.8)，云南昭通、廣西那坡、廣西三江及貴州安順地區(qū)的樣品相似度較低(＜0.8);藥材產(chǎn)地的不同，會(huì)導(dǎo)致溫度、日照、雨水等條件的不同，這些在中藥材生長過程中會(huì)起到非常重要的作用，必然會(huì)影響到藥材質(zhì)量。

本試驗(yàn)進(jìn)行通關(guān)藤有機(jī)酸HPLC－ ELSD 指紋圖譜的測(cè)定和分析，13 個(gè)成分峰的強(qiáng)度、分離度均比較好。本方法前處理簡單，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，可作為通關(guān)藤藥材的鑒別項(xiàng)之一，為選購原藥材及指導(dǎo)該藥材的GAP 種植提供依據(jù)。

［1］趙陸華，相秉仁，陸紅柳.烏骨藤藥材HPLC 指紋圖譜研究［J］.中成藥，2008

［2］劉峰群，曹紅，靳守東.通關(guān)藤注射液酚酸類成分指紋圖的HPLC 測(cè)定［J］.中成藥，2003

［3］謝培山.中藥色譜指紋圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005