猴頭菌原生質(zhì)體制備及單核體鑒定研究

張琪，劉宏偉，陳娟，郭順星

猴頭菌原生質(zhì)體制備及單核體鑒定研究

張琪，劉宏偉，陳娟，郭順星

目的 通過優(yōu)化猴頭菌原生質(zhì)體的制備條件，結(jié)合熒光染色鑒定及分子鑒定獲得高純度的單核體，為進(jìn)一步開展猴頭菌基因組水平的研究提供材料。

猴頭菌； 原生質(zhì)體； 單核體； 熒光染色

猴頭菌（Hericium erinareus）是一種珍貴的食藥用真菌，含有萜類、酚類等生物活性物質(zhì)，對(duì)提高人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)等具有顯著功效。尤其是猴頭菌子實(shí)體產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)成分猴頭菇菌素廣受國(guó)內(nèi)外關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)猴頭菌的研究多集中在活性成分分離及其藥理活性方面［1-2］，但對(duì)猴頭菌分子生物學(xué)尤其是活性成分的生物合成機(jī)制報(bào)道較少?；蚪M學(xué)技術(shù)的發(fā)展為深入研究猴頭菌次生代謝產(chǎn)物的合成提供有力工具。目前猴頭菌的功能基因組學(xué)研究尚未開展。猴頭菌子實(shí)體一般由二倍體菌株發(fā)育而來，含有兩套不同的染色體，基因組復(fù)雜度較高，測(cè)序解析困難。因此獲得單核體是基因組測(cè)序工作的前提和基礎(chǔ)。在獲得單核體的方法中，原生質(zhì)體單核化法所獲得的單倍體菌株不經(jīng)過重組，因而更能完整地展示二倍體親本的遺傳信息［3］。然而單核體的再生有一定的困難，所以需要高產(chǎn)量的原生質(zhì)體為基礎(chǔ)。酶解法是制備原生質(zhì)體的一種常用方法，而酶的種類、酶解條件、培養(yǎng)基的成分［4］都對(duì)原生質(zhì)體的釋放有很大的影響。本文優(yōu)化了猴頭菌原生質(zhì)體的制備條件，結(jié)合熒光染色及分子鑒定獲得了高純度的單核體，為進(jìn)一步開展猴頭菌基因組水平的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 發(fā)酵的猴頭菌菌絲由中國(guó)科學(xué)院微生物所提供，經(jīng) PDA培養(yǎng)基純化獲得，并經(jīng) DNA序列鑒定屬于猴頭菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，水 1000 ml，pH=5.5。葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水 1000 ml，碳源篩選時(shí)分別以麥芽糖、蔗糖、淀粉替代培養(yǎng)基中的葡萄糖。綜合培養(yǎng)基：在葡萄糖培養(yǎng)基中分別加入馬鈴薯、燕麥、麥麩各 200 g。除培養(yǎng)基篩選實(shí)驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)材料均用添加馬鈴薯的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。PDP培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基中除去 KH2PO4和MgSO4·7H2O。再生培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基中加入KCl，使終濃度為 0.6 mol/L。

1.1.3 試劑 溶壁酶購(gòu)自廣東微生物所；蝸牛酶及纖維素酶購(gòu)自北京佳辰科技有限公司；DAPI熒光染色劑購(gòu)自瑞士 Roche公司；CTAB植物基因組 DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 將發(fā)酵產(chǎn)物在 PDA平板上進(jìn)行活化。取培養(yǎng)皿邊緣菌絲，盡量打碎，以每 100 ml培養(yǎng)液接種一皿菌絲的比例進(jìn)行操作。接種后的菌絲先搖床培養(yǎng) 96 h（120 r/min，25℃），再靜置培養(yǎng) 72 h，整個(gè)操作需無菌且每個(gè)處理重復(fù) 3次。菌齡篩選實(shí)驗(yàn)中的靜置培養(yǎng)時(shí)間分別為 48、72、96、120、144 h。

1.2.2 原生質(zhì)體制備 發(fā)酵菌絲經(jīng)蒸餾水沖洗后用 0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑沖洗 3次，濾紙吸干水分。按照每 100 mg干濕菌絲加入 1 ml酶液的比例進(jìn)行酶解反應(yīng)［5］。反應(yīng)結(jié)束后采用 200目銅網(wǎng)過濾除去殘余菌絲，得到的濾液 5000 r/min離心10 min，所得沉淀用 0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑沖洗，最后用 1 ml 0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑溶解，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.3 原生質(zhì)體再生 將制得的原生質(zhì)體稀釋100倍，取 150 μl涂板，設(shè)置 3個(gè)重復(fù)。

單核菌絲再生率 =｛［（再生菌落數(shù) –再生雙核菌落數(shù)）×1000×100/3×150］/原生質(zhì)體數(shù)｝× 100%

1.2.4 影響原生質(zhì)體釋放的因素

酶系統(tǒng)篩選實(shí)驗(yàn)：觀察 1.5%的單一酶系統(tǒng)（溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶），1.5%的纖維素酶和蝸牛酶的混合酶系統(tǒng)，2%的溶壁酶系統(tǒng)酶解 2、3、4 h的原生質(zhì)體釋放過程。觀察溶壁酶濃度分別為 1%、1.5%、2%、3%、4%酶解 3 h的原生質(zhì)體釋放情況。

酶反應(yīng)體系中的因素篩選實(shí)驗(yàn)：酶解溫度、pH及滲透壓穩(wěn)定劑都對(duì)結(jié)果有影響。本文分別對(duì)穩(wěn)滲劑（無機(jī)和有機(jī)），pH（3.5～6.5）、酶解溫度（20～40℃）等條件進(jìn)行考察。

培養(yǎng)基及菌齡篩選實(shí)驗(yàn)：對(duì)碳源及綜合培養(yǎng)基中添加的成分進(jìn)行篩選。同時(shí)對(duì)菌齡為 48～144 h的菌絲進(jìn)行原生質(zhì)體釋放量的觀察。

1.2.5 單核菌絲鑒定 單核菌絲的鑒定方法包括：性狀鑒定、一般顯微鑒定、熒光顯微鑒定。用于熒光染色鑒定的菌絲用 3 mol/L的 DAPI熒光染液于 37℃ 染色 20 min，后用 PBS緩沖液沖洗3次置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。同時(shí)，使用CTAB法對(duì)獲得的單核菌絲進(jìn)行 DNA提取，采用擔(dān)子菌 ITS序列通用引物：ITS4/ITS5［6］（5'TCCT CCGCTTATTGATATGC 3'/5'GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGGA 3'）擴(kuò)增單核菌絲核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，將得到的序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。

2 結(jié)果

2.1 影響原生質(zhì)體釋放量的因素

2.1.1 酶系統(tǒng)的選擇 真菌的細(xì)胞壁比較特殊，含有多糖、蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)［7］，因此選擇合適的酶系統(tǒng)是這些多糖物質(zhì)降解的關(guān)鍵。試驗(yàn)是在 30℃，pH 5.5時(shí)，以 0.6 mol/L KCl為滲透壓穩(wěn)定劑的條件下進(jìn)行，取 3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

從圖 1可以看出各酶系統(tǒng)的最大釋放量均出現(xiàn)在 3 h處。濃度為 1.5%的單一酶系統(tǒng)中，溶壁酶的效果最好，蝸牛酶的效果最差。濃度為 1.5%的混合酶系統(tǒng)中，含 1%蝸牛酶的酶系統(tǒng)酶解效果較好，其結(jié)果與 1.5%溶壁酶所得結(jié)果相似，但考慮到混合酶體系操作繁瑣，所以選擇單一酶系統(tǒng)。將溶壁酶濃度增加到 2%，原生質(zhì)體的釋放量顯著增大。

圖1 酶系統(tǒng)對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響（R：溶壁酶；S：蝸牛酶；C：纖維素酶）Figure 1 The influence of enzyme type on the preparation of protoplast（R:lywallzyme；S:snailase；C:cellulose）

2.1.2 溶壁酶濃度對(duì)猴頭菌原生質(zhì)體制備率的影響 酶濃度是原生質(zhì)體釋放量的一個(gè)關(guān)鍵條件，濃度太低，破壁困難，原生質(zhì)體產(chǎn)量不足；濃度太高，易使原生質(zhì)體變形，甚至破裂，反而產(chǎn)量下降。

圖2表明，溶壁酶濃度較低時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨著酶濃度的增加而提高。溶壁酶濃度達(dá) 2%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為 2.11×107/ml，當(dāng)溶壁酶濃度超過 2.0%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶濃度的增加而降低。

圖2 溶壁酶濃度對(duì)猴頭原生質(zhì)體釋放量的影響Figure 2 The influence of lywallzyme concentration on the preparation of protoplast

2.1.3 培養(yǎng)基對(duì)猴頭原生質(zhì)體制備率的影響 培養(yǎng)基成分對(duì)真菌原生質(zhì)體的釋放量有顯著的影響［2］，由圖 3可以看出馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲的原生質(zhì)體釋放量最高為 1.53×107/ml。葡萄糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基所得釋放量較高，而蔗糖和淀粉的則較低，考慮是由于真菌不能利用蔗糖和淀粉導(dǎo)致的。PDP培養(yǎng)基的釋放量相對(duì)較低，說明 KH2PO4和 MgSO4·7H2O是培養(yǎng)基中必要的成分。燕麥培養(yǎng)基的釋放量最低，說明燕麥培養(yǎng)基不適合猴頭菌的生長(zhǎng)和原生質(zhì)體的釋放。本試驗(yàn)所用酶為 1.5%溶壁酶，其余條件同 2.1.1。

圖3 培養(yǎng)基的種類對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Figure 3 The influence of medium type on the preparation of protoplast

2.1.4 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)猴頭原生質(zhì)體制備率的影響 由圖 4可以看出以 KCl為穩(wěn)滲劑的原生質(zhì)體釋放量最高為 1.50×107/ml。其后依次是甘露醇、MgSO4·7H2O、葡萄糖、蔗糖和 NaCl。

2.1.5 菌齡對(duì)猴頭原生質(zhì)體制備率的影響 由圖 5可以看出，菌齡 72 h的菌絲所釋放的原生質(zhì)體的數(shù)量最多，為 1.69×107/ml。菌齡 48 h的菌絲釋放量較低，考慮是制得的原生質(zhì)體易破裂所致。菌齡超過 72 h，原生質(zhì)體釋放量呈逐漸減少的趨勢(shì)。

圖4 滲透壓穩(wěn)定劑的種類對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Figure 4 The influence of osmotic stabilizer type on the preparation of protoplast

圖5 菌齡對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響Figure 5 The influence of mycelial age on the preparation of protoplast

2.1.6 酶解溫度對(duì)猴頭原生質(zhì)體制備率的影響 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量影響顯著，隨著溶壁酶酶解溫度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量變化趨勢(shì)明顯。如圖 6所示，當(dāng)酶解溫度是 30℃ 時(shí)，其原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為 2.11×107/ml。溫度高于 35℃ 或低于 25℃ 時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著下降，因此，猴頭菌酶解溫度以 30℃ 為宜。

2.1.7 pH對(duì)猴頭原生質(zhì)體制備率的影響 由圖 7可知，pH 4.5～5.5效果相對(duì)較好，尤以 pH 5.5效果最佳。酶液的 pH條件主要影響溶壁酶系統(tǒng)和滲透壓穩(wěn)定劑活性，所以對(duì)猴頭菌來說 pH 4.5～5.5最適合溶壁酶的脫壁作用。

圖6 酶解溫度對(duì)猴頭原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Figure 6 The influence of hydrolysis temperature on the preparation of protoplast

圖7 pH對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Figure 7 The influence of pH on the preparation of protoplast

圖8 PDA平板培養(yǎng)的猴頭菌單核及雙核菌絲（A：菌齡 20 d的單核菌絲；B：菌齡 7 d的單核菌絲；C：菌齡 20 d的雙核菌絲；D：菌齡 7 d的雙核菌絲）Figure 8 The monokaryontic and multinucleated mycelia which cultured by PDA medium（A:Monokaryontic mycelia of 20 d；B:Monokaryontic mycelia of 7 d；C:Multinucleated mycelia of 20 d；D:Multinucleated mycelia of 7 d）

2.2 原生質(zhì)體的再生

對(duì)再生出的 32個(gè)菌落進(jìn)行篩選，鏡檢結(jié)果有24株有鎖狀聯(lián)合，涂板所用原生質(zhì)體的濃度為0.53×107/ml。單核菌絲的再生率為 0.034%。

2.3 單核菌絲的鑒定

2.3.1 性狀鑒定 單核菌絲生長(zhǎng)較規(guī)則、潔白（圖 8A、B）；雙核菌絲生長(zhǎng)不規(guī)則，且有分泌色素使培養(yǎng)基染色的情況發(fā)生（圖 8C、D）。顯微觀察顯示，單核菌絲分枝少，無鎖狀聯(lián)合（圖 9A）；雙核菌絲分枝較多，鎖狀聯(lián)合及孢子清晰可見（圖9B）。熒光染色觀察顯示，單核菌絲核距遠(yuǎn)，菌絲交叉較少（圖 10A）；雙核菌絲核距較近，菌絲交叉較多（圖10B）。

2.3.2 分子鑒定 測(cè)序得到的 ITS序列約650 bp，經(jīng) Blast與基因庫(kù)里的克隆自猴頭菌的一段序列相似，相似性達(dá) 99%，說明再生出來的為猴頭菌。

圖9 菌齡 20 d的單核及雙核菌絲的顯微結(jié)構(gòu)［A：?jiǎn)魏司z，比例尺：20 μm；B：雙核菌絲，可見鎖狀聯(lián)合及孢子（箭頭所示），比例尺：10 μm］Figure 9 Microstructure of monokaryontic and multinucleated mycelia of 20 d［A:Monokaryontic mycelia，scale bar，20 μm；B:Multinucleated mycelia，clamp connection and spores indicated by the black arrows，scale bar，10 μm］

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在綜合葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h的菌絲，用 2% 的溶壁酶液，以 0.6 mol/L KCl為滲透壓穩(wěn)定劑，在 pH 5.5的培養(yǎng)基條件下酶解3 h，可獲得最大量猴頭菌的原生質(zhì)體。制得的原生質(zhì)體再生后篩選出的菌絲經(jīng)顯微鑒定證明是單核菌絲，經(jīng)分子鑒定證明是猴頭菌。說明通過原生質(zhì)體單核化得到的菌絲可以用作猴頭菌基因組測(cè)序。

圖10 熒光顯微鏡觀察菌齡 20 d的單雙核菌絲，單、雙核清晰可辨［A：?jiǎn)魏司z熒光染色觀察，核距較遠(yuǎn)（箭頭所示），比例尺：10 μm；B：雙核菌絲熒光染色觀察，核距較近（箭頭所示），比例尺：10 μm］Figure 10 Microstructure of monokaryontic and multinucleated mycelia of 20 d using fluorescence microscope，mononuclear and dicaryon can be clearly recognized［A: Observationswith fluorescentstaining ofmonokaryontic mycelia，large separation between cell nucleus indicated by the white arrows，scale bar，10 μm；B:Observations with fluorescent staining of multinucleated mycelium，small separation between cell nucleus indicated by the white arrows，scale bar，10 μm］

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中所得最適菌齡為 72 h，與之前報(bào)道的96 h［8］有所不同，可能是由于所用培養(yǎng)基成分不同導(dǎo)致的，所以進(jìn)行培養(yǎng)基的成分篩選是很有必要的。此外本實(shí)驗(yàn)的原生質(zhì)體得率較李艷紅等［9］及劉莉等［10］得出的結(jié)果高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，可能的原因是本實(shí)驗(yàn)中采用的菌絲與酶類比例較高所致。

擔(dān)子菌的原生質(zhì)體釋放量同為 107個(gè)/ml數(shù)量級(jí)的試驗(yàn)中，再生率及再生單雙核菌絲之比差異較大。潘迎捷等［11］在研究香菇原生質(zhì)體的再生時(shí)，得出再生的單雙核菌絲之比為 0.85∶1～2.34∶1。李剛和李寶?。?2］在研究靈芝的原生質(zhì)體再生時(shí)，發(fā)現(xiàn)其菌絲再生率范圍為（1.44±0.14）×10-1～（5.42± 0.82）×10-1。范秀芝等［13］在研究黑木耳時(shí)，發(fā)現(xiàn)單雙核菌絲再生率之比為 25∶17。本實(shí)驗(yàn)單核菌絲的再生率為 0.034%，單雙核菌絲再生率比約為 1∶3。本實(shí)驗(yàn)中菌絲再生率及單核菌絲再生比例均較低，考慮是由于再生培養(yǎng)基瓊脂的含量、原生質(zhì)體的涂布量以及滲透壓穩(wěn)定劑種類等因素導(dǎo)致的，因此今后的研究可進(jìn)一步對(duì)原生質(zhì)體再生條件進(jìn)行優(yōu)化。

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Methods The preparation conditions of Hericium erinaceus protoplast were studied systematically.These conditions included three types of enzyme systems；concentrations of lywallzyme；inorganic and organic osmotic stabilizers；pH 3.5～6.5；decomposition temperature between 20～40℃，and medium component and mycelium age.Three types of enzyme systems were 1.5%single enzyme system （lywallzyme，cellulose，snailase），1.5%mixed enzyme system consisting of cellulase and snailase and 2% lywallzyme system.The concentrations of lywallzyme were 1%，1.5%，2%，3%and 4%.The medium components included type of carbon source and additive ingredients in synthetic medium.Mycelial age changed from 48 h to 144 h.The protoplast was diluted and inoculated on the regeneration plate.The regenerative mononuclear body is selected by morphological identification，observation of general and fluorescence microscope，and molecular identification by ITS analysis.

Results The highest yield of protoplast can be acquired by using the liquid fermentation mycelium which were cultured in potato medium for 72 h.The optimal treatment conditions consisted of 2%lywallzyme in 0.6 mol/L KCl，pH 5.5 and 30℃.

Conclusion The mononuclear body which is regenerated from protoplast can lay a foundation for genomic study of the Hericium erinaceus secondary metabolism.

Study on the preparation of protoplast and mononuclear identification of Hericium erinaceus

ZHANG Qi，LIU Hong-wei，CHEN Juan，GUO Shun-xing

Objective To obtain the mononuclear mycelia for further genomic research.

Hericium erinaceus；Protoplasts；Mononuclear mycelia；Fluorescent dyeing

s:GUO Shun-xing，Email:sxguo1986@163.com；CHEN Juan，Email:kibchenjuan@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.004

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2014CB138304）作者單位：250000濟(jì)南，山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（張琪）；100101北京，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所（劉宏偉）；100193北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所（陳娟、郭順星）

陳娟，Email：kibchenjuan@126.com；郭順星，Email：sxguo1986@163.com

2014-09-29

方法 對(duì)三類酶系統(tǒng)、溶壁酶濃度、無機(jī)和有機(jī)兩類穩(wěn)滲劑、pH 3.5～6.5、酶解溫度 20～40℃、培養(yǎng)基成分以及菌齡為48～144 h菌絲的原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行考察。其中三類酶系統(tǒng)分別為：1.5%的單一酶系統(tǒng)（溶壁酶、纖維素酶、蝸牛酶），1.5%的纖維素酶和蝸牛酶的混合酶系統(tǒng)，2%的溶壁酶系統(tǒng)；溶壁酶濃度：1%、1.5%、2%、3%、4%；培養(yǎng)基成分的考察：碳源種類篩選及綜合培養(yǎng)基中添加成分的篩選。將制得的原生質(zhì)體稀釋后涂板再生及鑒定，以選取單核菌絲。單核菌絲的鑒定方法包括：性狀、顯微及分子鑒定。其中顯微鑒定的觀察方法包括一般顯微觀察和 DAPI熒光染色觀察；分子鑒定擴(kuò)增的是單核菌絲的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列。

結(jié)果 在馬鈴薯培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng) 72 h的猴頭菌絲，用2% 的溶壁酶液，以 0.6 mol/L KCl為滲透壓穩(wěn)定劑，在 pH 5.5、溫度 30℃ 的條件下酶解 3 h，原生質(zhì)體的釋放量最大；再生的單核體經(jīng)形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定證明是猴頭菌。結(jié)論 通過原生質(zhì)體制備及再生方法獲得的猴頭菌的單核菌絲可以為猴頭菌活性次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（2）:113-118

Author Affiliations:Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250000，China（ZHANG Qi）；Institute of Microbiology，Chinese Academy of Science，Beijing 10010，China（LIU Hong-wei）；Institute of Medical Plant Development，ChineseAcademy of Medical Science&Peking Union Medical College，Beijing 100193，China（CHEN Juan，GUO Shun-xing）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:113-118