透骨消痛顆粒干預(yù)OA早期 COX-2和iNOS表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

高雪偉 （中船武漢六七二醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430079）

透骨消痛顆粒干預(yù)OA早期 COX-2和iNOS表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

高雪偉 （中船武漢六七二醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430079）

目的：通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)探討透骨消痛顆粒對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎早期環(huán)氧化酶-2（COX-2）和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)的影響，研究透骨消痛顆粒在膝骨性關(guān)節(jié)炎治療中的相關(guān)作用機(jī)制．方法：新西蘭大白兔采用改良Hulth法造模，造模成功后隨機(jī)分成3組：模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，和正常組共4組，分別灌胃給藥4周后處死動(dòng)物取材，并觀測(cè)如下指標(biāo)：關(guān)節(jié)腔大體觀察，滑膜與軟骨組織學(xué)觀察；關(guān)節(jié)液內(nèi) NO、NOS、PGE2含量檢測(cè)，滑膜軟骨中iNOS、COX-2含量檢測(cè)．結(jié)果：4周后關(guān)節(jié)液中 NO、NOS含量、PGE2濃度，滑膜和軟骨中iNOS、COX-2含量，模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組均呈高表達(dá)，與正常組比較差異有顯著性（P＜0．05）；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與模型組比較差異有顯著性（P＜0．05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較差異有顯著性（P＜0．05）．結(jié)論：透骨消痛顆?？赏ㄟ^(guò)抑制COX-2和 iNOS在 OA早期滑膜和軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及其誘導(dǎo)產(chǎn)物PGE2和 NO的生成，從而達(dá)到控制OA早期炎癥、減輕疼痛、緩解癥狀的作用．

透骨消痛顆粒；骨性關(guān)節(jié)炎；滑膜；軟骨；COX-2；iNOS；NO；PGE2

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種多發(fā)病，常見(jiàn)于中老年人群，在我國(guó)其患病率40歲以上人群為10%～17%，60歲以上為 50%，75歲以上則達(dá)80%，而該病最終致殘率為53%［1］，是影響中老年人活動(dòng)最常見(jiàn)的原因．透骨消痛顆粒重要成分為杭白芍、巴戟天、川芎和腫節(jié)風(fēng)，全方具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效．輔以活血化淤、舒筋通絡(luò)、祛風(fēng)除濕的治療效果，對(duì)改善膝 OA的癥狀有著良好療效．本課題擬通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)探討透骨消痛顆粒對(duì) OA早期環(huán)氧化酶-2（COX-2）和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)的影響，探討透骨消痛顆粒治療膝 OA療效作用機(jī)制．

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，6月齡，實(shí)驗(yàn)對(duì)象空腹體重為（2 100±100）g，雌性30只、雄性30只，全部由上海醫(yī)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并安全運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)地（福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院的動(dòng)物中心進(jìn)行），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2008-0009．經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周．

1．2 藥物制備 透骨消痛顆粒：所需中藥顆粒劑均由福建省第二人民醫(yī)院制劑室提供，制成水煎劑，每10 mL含生藥1．12 g．壯骨關(guān)節(jié)丸（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44023377）；鹽酸氯胺酮注射液（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32O22820）；注射用青霉素鈉80萬(wàn) u（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H37021950）；滅菌注射用水（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H44020786）．

1．3 主要試劑 一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20081215）；一氧化氮合成酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20081215）；PGE2（ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，批號(hào)：0811165）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶原位雜交試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司提供，批號(hào)20080908）；COX-2免疫組化全套試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司，批號(hào)：20060408）．

1．4 主要儀器 酶標(biāo)儀（ELX808U），美國(guó) BIO-TEK公司；半自動(dòng)生化分析儀（BT224），意大利生物技術(shù)公司；離心機(jī)（DDL-5），上海安亭科學(xué)儀器廠；醫(yī)用冰箱（MDF-U5410），SANYO；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴箱（HH1600），上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；微量振蕩器（ZW-A），常州國(guó)華電器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（ELx50），美國(guó)BIO-TEK公司．

1．5 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 采用抽簽法隨機(jī)分為正常組（15只）和造模組（45只）．正常組兔子予以正常飼養(yǎng)看護(hù)；造模組兔子在常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備基礎(chǔ)上行改良Hulth法造模［2］．造模成功后再用抽簽法隨機(jī)分成3組：模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組15只（表1）．模型組兔子予以生理鹽水10 mL／d灌胃處理；對(duì)照組兔子則用壯骨關(guān)節(jié)丸水溶液10 mL／d（含壯骨關(guān)節(jié)丸1．12 g）灌胃處理；實(shí)驗(yàn)組給予透骨消痛顆粒水溶液10 mL／d（含生藥量1．12 g）灌胃，共4周．

表1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 （n＝15）

在驅(qū)趕過(guò)程中，兔群相互擠壓、踩塌造成外傷致死有2只，分別在模型組和實(shí)驗(yàn)1組；在灌胃過(guò)程中，藥物溶液返流導(dǎo)致誤吸死亡4只，模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)1、2組各1只．

1．6 標(biāo)本取材 采用耳緣靜脈麻醉的方法對(duì)藥物干預(yù)4周的兔子進(jìn)行麻醉，將麻醉后的兔子于右膝半屈曲位置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，定位關(guān)節(jié)腔穿刺點(diǎn)，緩慢注入 1 mL生理鹽水，之后反復(fù)活動(dòng)關(guān)節(jié)，待充分接觸后抽取關(guān)節(jié)液至EP管內(nèi)，4 000 r／min離心 10 min取上清液，在 －20℃環(huán)境下保存．處死并解剖兔子，觀察關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)．刀片切取大小約為0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm的內(nèi)側(cè)滑膜組織塊，脛骨、股骨髁關(guān)節(jié)軟骨修成0．5 cm×0．5 cm合適厚度軟骨片．

1．7 組織學(xué)及生化檢測(cè) 滑膜和軟骨標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，脫水處理并石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片后 HE染色、光鏡下組織學(xué)觀察．節(jié)液中NO、NOS活性采用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，PEG2采用PGE2（ELISA）試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，軟骨和滑膜組織中 iNOS采用iNOS試劑盒測(cè)定含量，滑膜、軟骨COX-2表達(dá)采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)．

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及分析，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0．05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 關(guān)節(jié)腔大體形態(tài)學(xué)觀察 正常組關(guān)節(jié)軟骨外觀呈淺藍(lán)白色，半透明；關(guān)節(jié)面光滑平整、色澤明亮，無(wú)裂紋及軟化灶；關(guān)節(jié)邊緣整齊規(guī)則，無(wú)骨贅形成．滑膜外觀呈白色，潤(rùn)澤明亮，內(nèi)表面光滑白亮向關(guān)節(jié)腔突出形成常說(shuō)的滑膜皺襞；關(guān)節(jié)液呈淡黃色純凈液體，量少質(zhì)稠．模型組關(guān)節(jié)軟骨呈淡黃色；關(guān)節(jié)表面粗糙糜爛、潰瘍形成，失去光澤，軟骨缺損淺深不一，以致軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露；關(guān)節(jié)邊緣不規(guī)則，有明顯骨贅次形成．滑膜外觀明顯增生肥厚粘連；關(guān)節(jié)液明顯增多，色質(zhì)渾濁．對(duì)照組關(guān)節(jié)腔大體形態(tài)學(xué)變化介于模型組和實(shí)驗(yàn)組之間．實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨呈微黃色，關(guān)節(jié)面光澤尚存，關(guān)節(jié)表面部分粗糙未見(jiàn)明顯糜爛、潰瘍，軟骨部分區(qū)域缺損較表淺，未見(jiàn)大面積剝脫，軟骨下骨質(zhì)未見(jiàn)明顯暴露；關(guān)節(jié)邊緣欠規(guī)則，可見(jiàn)少量骨贅形成．滑膜外觀部分增生肥厚及粘連；關(guān)節(jié)液增多，色質(zhì)稍渾濁．

2．2 滑膜及軟骨組織學(xué)觀測(cè) 正常組滑膜完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)充血水腫、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）．模型組滑膜肉芽組織纖維化（瘢痕形成），伴有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）．對(duì)照組滑膜細(xì)胞呈乳頭狀增生，滑膜內(nèi)血管增生，肉芽組織形成（圖1C）．實(shí)驗(yàn)組滑膜充血水腫，表層細(xì)胞增生（圖1D）．

圖1 滑膜及軟組織學(xué)觀測(cè)（×100）

2．3 關(guān)節(jié)液中 NO、NOS、PGE2含量測(cè)定 表 2顯示，模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液中NO、NOS、PGE2含量均呈高表達(dá)，與正常組相比差異具有顯著性（P＜0．05），說(shuō)明在膝 OA早期發(fā)病過(guò)程中是重要的炎癥介質(zhì)．關(guān)節(jié)液中的 NO、NOS含量對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與模型組有顯著性差異（P＜0．05），對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比有顯著性差異（P＜0．05）．對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與模型組在關(guān)節(jié)液中 PGE2含量上有顯著差異（P＜0．05），且對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組兩者相比較，同樣具有差異（P＜0．05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

表2 關(guān)節(jié)液 NO、NOS、PGE2測(cè)定結(jié)果比較 （±s）

表2 關(guān)節(jié)液 NO、NOS、PGE2測(cè)定結(jié)果比較 （±s）

aP＜0．05 vs正常組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs對(duì)照組．

組別 n NO（mmol／L） NOS（U／mL） PGE2（pmol／L）

2．4 滑膜和軟骨中 iNOS測(cè)定 表3顯示，模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組中 iNOS均呈高表達(dá)，與正常組相比差異具有顯著性（P＜0．05），說(shuō)明在膝OA早期發(fā)病炎癥病變過(guò)程中是重要的酶介質(zhì)．滑膜和軟骨中 iNOS含量對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與模型組有顯著性差異（P＜0．05），對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比有顯著性差異（P＜0．05）．

表3 滑膜和軟骨中 iNOS測(cè)定結(jié)果比較±s，u／mg）

表3 滑膜和軟骨中 iNOS測(cè)定結(jié)果比較±s，u／mg）

aP＜0．05 vs正常組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs對(duì)照組．

?

2．5 滑膜、軟骨 COX-2表達(dá)結(jié)果 表4顯示，正常組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組均高于模型組（P＜0．05）；實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．以上數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)組 COX-2的陽(yáng)性表達(dá)要弱于模型組及對(duì)照組．

表4 滑膜和軟骨中 COX-2陽(yáng)性表達(dá)灰度值（±s）

表4 滑膜和軟骨中 COX-2陽(yáng)性表達(dá)灰度值（±s）

aP＜0．05 vs正常組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs對(duì)照組．

組別 n 滑膜 軟骨正常組15 213±14 235±23模型組 13 139±14a145±15a對(duì)照組 14 225±13ac213±15ac實(shí)驗(yàn)組 14 229±15ace221±13ace

3 討論

膝OA在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中當(dāng)屬痹證范疇，根據(jù)“痛著不通，不通則痛”的中醫(yī)理論，膝OA出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛時(shí)定有“瘀”，此瘀當(dāng)責(zé)之于肝腎，肝腎氣血虧虛，氣虛則血運(yùn)無(wú)力，漸可致瘀．而且本病多見(jiàn)于老年肥胖女性，中醫(yī)素有“肥人多痰”的理論，故本病尚涉及脾［3－4］．治則以補(bǔ)虛為先，陰陽(yáng)共補(bǔ)，陰中求陽(yáng)．結(jié)合本病特點(diǎn)，宜壯陽(yáng)稍強(qiáng)，以求平衡陰陽(yáng)兼有祛邪；活血化瘀應(yīng)兼行氣止痛；血不養(yǎng)筋、寒之收引易致筋脈拘攣，所以柔肝舒筋之藥不可少；且勿忘健脾調(diào)胃．以達(dá)利濕化痰的目的．所以，本方以補(bǔ)腎作為治療膝 OA的根本法則，兼以補(bǔ)腎養(yǎng)肝，活血健脾，利濕化痰．

國(guó)內(nèi)外大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié) OA病理變化的炎癥途徑中，NO和 COX-2起到很重要的作用，兩項(xiàng)由炎癥因子介導(dǎo)的炎癥途徑是通過(guò)對(duì)滑膜和軟骨營(yíng)養(yǎng)交換、骨基質(zhì)合成、輕微損傷后修復(fù)等途徑的干預(yù)和損害，導(dǎo)致OA病理過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍，軟骨下骨的硬化與象牙化，骨贅形成和軟骨下骨囊腫，以及滑膜組織損傷和血管擴(kuò)張，組織滲出，導(dǎo)致滑膜腫脹，造成關(guān)節(jié)腔積液、滑膜增生肥厚粘連軟骨，以上所述病理變化最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)活動(dòng)功能減退以致障礙［5－7］．透骨消痛顆粒是以“腎主骨”、“肝主筋”、“膝為筋之府”等中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，以補(bǔ)腎作為治療膝 OA的根本法則（藥以巴戟天等溫陽(yáng)補(bǔ)腎之品治本；劉獻(xiàn)祥等在透骨消痛顆粒防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)理研究中將其簡(jiǎn)要的歸納為五要：①補(bǔ)腎要去邪，邪去痹自滅；②補(bǔ)腎要活血，血行痹自解；③補(bǔ)腎藥健脾，脾健痹自去；④補(bǔ)腎藥養(yǎng)肝，肝腎同源，肝腎痛健痹自殲；⑤補(bǔ)腎藥止痛，痛解痹自停．

本實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程用改良HUILTH法復(fù)制兔膝關(guān)節(jié)OA模型，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集檢測(cè)及觀察，可顯示膝關(guān)節(jié)OA病理變化過(guò)程中的軟骨的軟化、纖維化，減少潰瘍和軟骨下骨的硬化與象牙化，降低軟骨下骨囊腫與骨贅形成，控制滑膜組織的損傷和滲出．保護(hù)血管，減輕其因擴(kuò)張而導(dǎo)致的滑膜腫脹、關(guān)節(jié)腔積液、滑膜增生肥厚粘連軟骨等標(biāo)志性的病變，可以印證大多數(shù)相關(guān)研究中對(duì)應(yīng)病理過(guò)程．在相關(guān)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比中可以發(fā)現(xiàn)，透骨消痛顆粒在膝 OA病理變化可以起到減輕 OA病理變化中的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的退變，減輕膝關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛、關(guān)節(jié)功能退變．試驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)在兔膝關(guān)節(jié)OA過(guò)程中NOS和COX-2途徑起到了重要作用，透骨消痛顆?？梢砸种七@兩條炎癥途徑．

［1］劉獻(xiàn)祥，李西海，周江濤．改良 Hulth造模法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（12）：1104－1106．

［2］鄭永智，孫永強(qiáng)，王上增．關(guān)節(jié)鏡治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎化膿性感染的臨床分析［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（15）：3815－3817．

［3］黃云梅，陳文列，林如輝，等．透骨消痛膠囊促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化［J］．中國(guó)組織工程研究，2013，17（33）：5923－5928．

［4］陳 燕，肖曉金，包俠萍，等．透骨消痛方鎮(zhèn)痛抗炎作用實(shí)驗(yàn)研究［J］．中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，28（11）：1675－1676，1685．

［5］袁望舒，陳麗霞，劉淑芬．負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨及血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影響［J］．中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜，2014，36（2）：81－85．

［6］吳汝平，趙品益．中醫(yī)手法聯(lián)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉治療膝骨性關(guān)節(jié)炎臨床分析［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（5）：1219－1221．

［7］甕長(zhǎng)水，郭燕梅，陳 蔚，等．80歲及以上膝骨性關(guān)節(jié)炎患者等速肌力與疼痛和功能狀態(tài)的關(guān)系［J］．中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2014，33（7）：718－721．

The Experimental Research about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis

GAO Xue-Wei
The 672 Hospital of Wuhan，Department of Orthopaedic，Wuhan 430079，China

AIM：To investgate the mechanism of influence about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis by animals experiment，to investgate mechanism of granula of penetrating bone removeing pain on treatment of osteoarthritis．METHODS：We devided the New Zealand rabbits into 3 groups randomly after replicated knee osteoarthritis with modified Hulth modeling method：model group，control group，experimental group，with the normal group were 4 groups in total．We execute all rabbits after they were fed intragastically for 4 weekes．Then the following detection were taken out：General Observation of articular cavity；histological Conversation of synovium and cartilage；content of NOS，NO，test of iNOSmRNA，concentration of COX-2 and PGE2 within joint．RESULTS：After four weekes，there was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of model group，control group，experimental group compared with the normal group；There was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of experimental groups and control group compared with the model group；There was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of experimental group compared with control group．CONCLUSION：The granula of penetrating bone removeing pain can control inflammation，relieve pains and alleviate symptoms in early stage of osteoarthritis by inhibiting the expression of COX-2 and iNOS within cartilage and synovium and releving the production of PGE2 and NO which can be inducktived by COX-2 and iNOS．

granula of penetrating bone removeing pain；osteoarthritis；synovium；cartilage；COX-2；Inos；NO；PGE2

R274．32；R684．3

A

2095-6894（2015）01-015-04

2014-12-10；接受日期：2014-12-30

高雪偉．碩士．E-mail：119077056@qq．com