BMSCs復(fù)合PHBV原位修復(fù)兔鼻中隔軟骨缺損的實驗研究

陳思綺 王健

·論著·

BMSCs復(fù)合PHBV原位修復(fù)兔鼻中隔軟骨缺損的實驗研究

陳思綺 王健

目的探索BMSCs復(fù)合PHBV原位修復(fù)兔鼻中隔軟骨缺損的可行性。方法建立兔鼻中隔軟骨缺損模型。將36只健康新西蘭大白兔隨機分成3組。實驗組：軟骨缺損處植入BMSCs-PHBV復(fù)合物進行修復(fù)；對照組：軟骨缺損處植入單純PHBV支架材料進行修復(fù)。空白組：單純?nèi)〕霰侵懈糗浌?，不予修?fù)。分別于16、24周取材，行大體觀察及組織學(xué)檢測。結(jié)果大體觀察顯示，實驗組新生軟骨樣組織將鼻中隔軟骨缺損區(qū)填充修復(fù)，與周圍軟骨組織未見明顯分界；對照組新生軟骨薄，與周圍組織分界明顯；空白組鼻中隔軟骨缺損區(qū)未生成軟骨組織，缺損部位及其周圍正常軟骨組織被纖維結(jié)締組織充填覆蓋。組織學(xué)檢測顯示，實驗組構(gòu)建的軟骨組織結(jié)構(gòu)致密，基質(zhì)及Ⅱ型膠原顯色程度均明顯強于對照組構(gòu)建的軟骨。結(jié)論BMSCs-PHBV復(fù)合物能有效修復(fù)兔鼻中隔軟骨缺損。

鼻中隔軟骨骨髓基質(zhì)干細胞再生醫(yī)學(xué)原位修復(fù)

鼻中隔位于鼻部中央，是鼻的主要支撐結(jié)構(gòu)，也是構(gòu)成鼻部金字塔形狀的重要基礎(chǔ)。鼻中隔軟骨是鼻下2/3的最主要支撐結(jié)構(gòu)，由中間薄片狀的軟骨（骨）及兩側(cè)的鼻黏膜構(gòu)成。鼻中隔作為鼻部的中線骨架，在青少年生長發(fā)育的過程中，對鼻子以及周圍面部組織的生長有重要的作用，在結(jié)構(gòu)以及功能上，和側(cè)鼻軟骨共同成為內(nèi)部鼻閥[1]，并對鼻部的軟組織、軟骨組織和鼻腔起到支撐的作用，并最終決定成年后鼻子的基本形態(tài)[2]。因此，各種先天性或獲得性的鼻中隔畸形都會嚴重影響鼻部的功能和外形[3]，導(dǎo)致鼻背、鼻尖缺損和畸形，鼻小柱短小塌陷，鼻尖上翹等表現(xiàn)，嚴重者可致鼻梁塌陷，臨床上稱之鞍鼻畸形[2]，同時可引起不同程度的通氣障礙。目前，國內(nèi)外修復(fù)鼻中隔軟骨缺損的各種方法均有報道，但并未達成共識。常用方法有人工假體植入、自體骨或軟骨移植等[4]。但由于材料自體性質(zhì)及鼻中隔部位的特殊結(jié)構(gòu)等原因，以上方法均存在不足之處。如：因鼻中隔缺損繼發(fā)的嚴重鞍鼻畸形較為復(fù)雜，一般鼻下部的自體軟骨或硅膠的填充不能奏效，反而容易壓迫鼻下部而致通氣不暢[5]。自體骨或軟骨作為移植材料，來源極為有限，不僅增加了手術(shù)痛苦，形成供區(qū)骨或軟骨缺損，且存在不易雕刻、容易變形、移植后可被吸收等缺點。人工材料雖然便于雕刻塑形、不易被吸收，但其植入后產(chǎn)生的異物反應(yīng)和感染尚未得到較好解決，且體內(nèi)長期穩(wěn)定性無法保證。

組織工程學(xué)在應(yīng)用細胞生物學(xué)和工程學(xué)的基礎(chǔ)上得到迅速的發(fā)展，內(nèi)容涉及種子細胞、生物支架材料以及組織構(gòu)建等眾多研究方向，為軟骨缺損的修復(fù)打開了一扇新的大門。本實驗選用成年新西蘭兔為實驗動物，兔的鼻中隔結(jié)構(gòu)由四邊形鼻中隔軟骨、犁骨、篩骨垂直板構(gòu)成，盡管有細節(jié)上的差異，兔的鼻部解剖結(jié)構(gòu)和人體還是十分相似的[6-7]。我們利用骨髓穿刺收集兔的自體骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs），進行體外培養(yǎng)、擴增，種植于PHBV支架材料上；體外培養(yǎng)后，將BMSCs-PHBV復(fù)合物移植到原鼻中隔軟骨缺損處，完成軟骨缺損的修復(fù)；利用組織學(xué)染色對新生的鼻中隔軟骨進行檢測，為組織工程技術(shù)修復(fù)鼻中隔軟骨缺損提供實驗依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 主要試劑

Percoll原液、Ham/F12培養(yǎng)基、L-谷胺酰胺、青霉素、磷酸鹽緩沖液、高糖DMEM培養(yǎng)液、4%乙酸溶液、II型膠原蛋白酶、戊巴比妥鈉、多聚甲醛、戊二醛、低糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶－0.2%ETDA（Sigma公司，美國）；兔抗兔Ⅱ型膠原抗體（Santa公司，美國）；胎牛血清、三抗（Hyclone公司，美國）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

低溫高速離心機（Thermo公司，美國）；細胞培養(yǎng)超凈臺（蘇凈公司，中國）；電熱恒溫水浴鍋（精宏實驗設(shè)備有限公司，中國）；掃描電鏡（Leica S90，日本）；Multiskan MK3全自動酶標儀（賽默飛世爾科技公司，美國）；水平搖床（SCILOGEX，美國）；細胞計數(shù)板（求精生化試劑儀器有限公司，中國）；低速自動平衡離心機（醫(yī)用離心機廠，中國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，德國）。

1.2 兔鼻中隔軟骨缺損模型的建立

1.2.1 動物分組

健康新西蘭大白兔36只（我院動物實驗中心提供），體質(zhì)量2.0～3.0 K g，雌雄不限，雌性未孕，實驗前分籠飼養(yǎng)1周。

所有動物隨機分成3組。實驗組：軟骨缺損處植入BMSCs-PHBV復(fù)合物進行修復(fù)；對照組：軟骨缺損處植入單純PHBV支架材料進行修復(fù)；空白組：單純?nèi)〕霰侵懈糗浌牵挥栊迯?fù)。植入后16、24周取材觀察。

1.2.2 模型的建立

實驗兔術(shù)前禁食、水6 h。肌肉注射氯胺酮麻醉，將兔俯臥固定于實驗臺上，術(shù)區(qū)脫毛、消毒、鋪巾。鼻中部4 cm左右縱行切口，逐層分離皮膚、皮下組織及骨膜。在鼻骨中部作2 cm左右縱行切口，確定鼻中隔位置，以鼻中隔剝離子沿鼻中隔軟骨在軟骨膜下分離兩側(cè)黏膜及兩側(cè)鼻軟骨。用直角剪剪取0.5 cm×1 cm的鼻中隔軟骨，建立鼻中隔軟骨缺損模型（圖1）。

圖1 兔鼻中隔缺損模型的建立Fig.1 The establishment of nasal septum injury in rabbit model

1.3 BMSCs-PHBV復(fù)合物修復(fù)鼻中隔軟骨缺損

1.3.1 兔骨髓間質(zhì)干細胞提取和培養(yǎng)

抽取5 m L兔骨髓，加入10 m L低糖DMEM中，2 000 r/min離心10 min，吸除脂肪和上清液，重新振蕩搖勻制成細胞懸液。將Pcrcoll分離液（2×骨髓細胞懸液，置入15 m L離心管）加入骨髓細胞懸液，2 000 r/min離心30 min，吸取有核細胞至另一離心管。加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)液10 m L，2 000 r/min離心10 min，反復(fù)操作3次。以2×105cells/cm2的細胞密度接種至直徑100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。48 h后除去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS洗滌3次，加入10 mL含血清低糖DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。每天換液1次。6～8 d后細胞可達到融合狀態(tài)，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA進行傳代。

1.3.2 BMSCs-PHBV復(fù)合物的制備

將PHBV材料裁剪為1 cm×0.5 cm大小的長方形，環(huán)氧乙烷消毒，置于6孔板中。將100μL的細胞懸液滴加在PHBV支架上，37℃、5%CO2、95%濕度下培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，將支架完全浸入含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3.3 BMSCs-PHBV復(fù)合物植入缺損部位

將BMSCs-PHBV復(fù)合物（實驗組）或PHBV支架材料（對照組）植入鼻中隔軟骨缺損部位（圖2）。生理鹽水清洗術(shù)區(qū)與周圍組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)，肌注抗生素3 d，密切觀察動物生存情況。

圖2 BMSCs-PHBV復(fù)合物植入缺損部位Fig.2 The implantation of BMSCs-PHBV complication into nasal cartilage defects

1.4 實驗相關(guān)檢測

1.4.1 BMSCs-PHBV復(fù)合物電鏡觀察

取體外培養(yǎng)7 d的BMSCs-PHBV復(fù)合物，PBS漂洗，2.5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

1.4.2 大體標本觀察

分別在術(shù)后16周和24周時，完整取出鼻中隔軟骨，觀察軟骨缺損區(qū)的修復(fù)情況，包括軟骨形態(tài)、色澤、彈性等的觀察。

1.4.3 組織學(xué)檢測

分別于術(shù)后16周和24周取材。4%多聚甲醛固定24 h、脫水、石蠟包埋、切片，HE及Ⅱ型膠原免疫組化染色，觀察標本的組織結(jié)構(gòu)、軟骨基質(zhì)著色及Ⅱ型膠原表達情況。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs-PHBV復(fù)合物電鏡觀察

體外培養(yǎng)1周的BMSCs-PHBV復(fù)合物掃描電鏡觀察顯示：完整融合成連續(xù)細胞層的BMSCs，在支架表面黏附伸展，匯合成片后覆蓋在大部分材料表面，并且分泌細胞外基質(zhì)（圖3）。

圖3 BMSCs-PHBV復(fù)合物體外培養(yǎng)7 d掃描電鏡觀察Fig.3 SEM observation of the BMSCs-PHBV complex cultured for 7 days in vitro

2.2 大體觀察

術(shù)后16周，3組均可見增生的纖維結(jié)締組織，緊貼軟骨表面，難以去除?？瞻捉M見0.5 cm×0.5 cm缺損，對照組見0.1 cm×0.1 cm的缺損，實驗組雖未見缺損，但其缺損處新生的軟骨組織較正常的軟骨組織?。▓D4）。

圖4 術(shù)后16周軟骨缺損重建大體觀Fig.4 The gross observation of the tissue engineered cartilage 16 weeks after operation

術(shù)后24周，對照組和空白組皆可見增生的纖維結(jié)締組織，較術(shù)后16周更為嚴重?？瞻捉M軟骨缺損處被纖維結(jié)締覆蓋，未見新生軟骨組織。對照組缺損部位的新生軟骨薄，且與正常軟骨組織分界明顯，表面覆蓋纖維結(jié)締組織。實驗組的缺損部位已被新生軟骨組織覆蓋充填，厚薄、色澤、質(zhì)地、形態(tài)與周圍正常軟骨組織相似，未見明顯分界（圖5）。

圖5 術(shù)后24周軟骨缺損重建大體觀Fig.5 The gross observation of the tissue engineered cartilage 24 weeks after operation

2.3 鼻中隔軟骨缺損部位HE染色

實驗組缺損區(qū)術(shù)后16周或24周皆可見典型的軟骨陷窩，內(nèi)有細胞核，大多位于陷窩中央，核仁明顯，周圍有藍染的細胞外基質(zhì)沉積，中空現(xiàn)象不明顯，細胞密度均勻，細胞排列規(guī)則平整，但術(shù)后16周缺損部位與周圍正常軟骨組織之間的界限，較術(shù)后24周更為明顯。對照組缺損區(qū)，術(shù)后16周可見纖維結(jié)締組織填充，軟骨陷窩結(jié)構(gòu)幼稚，中空現(xiàn)象明顯，與周圍正常軟骨組織可見分界；術(shù)后24周的軟骨缺損部位，完全被纖維結(jié)締組織填充，缺損部位和周圍正常軟骨組織形成明顯分界（圖6、7）。

圖6 術(shù)后16周HE染色（200×）Fig.6 The results of HE staining of nasal septal cartilage 16 weeks after operation(200×)

圖7 術(shù)后24周HE染色（200×）Fig.7 The results of HE staining of nasal septal cartilage 24 weeks after operation(200×)

2.4 鼻中隔軟骨缺損部位Ⅱ型膠原免疫組化染色

Ⅱ型膠原免疫組化染色示，隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組和實驗組新生組織中軟骨陷窩逐步成熟，術(shù)后24周細胞外特異性Ⅱ型膠原含量較術(shù)后16周更多。術(shù)后16周或24周，實驗組新生軟骨組織的軟骨結(jié)構(gòu)均比對照組更為成熟，細胞外基質(zhì)表達更強烈，細胞密度均勻、排列規(guī)則，與周圍正常軟骨組織的界限也較不明顯（圖8、9）。

圖8 術(shù)后16周Ⅱ型膠原免疫組化染色（200×）Fig.8 The results of TypeⅡcollagen immunohistochemistry of nasal septal cartilage 16 weeks after operation(200×)

圖9 術(shù)后24周Ⅱ型膠原免疫組化染色（200×）Fig.9 The results of TypeⅡcollagen immunohistochemistry of nasal septal cartilage 24 weeks after operation(200×)

3 討論

腫瘤、感染、外傷、手術(shù)等是造成鼻中隔軟骨缺損或穿孔的常見原因。軟骨組織本身缺乏未分化細胞，并缺少神經(jīng)、淋巴和血管的分布，且致密的膠原蛋白多糖基質(zhì)將軟骨細胞包裹，限制其增殖和遷移。因此，損傷后自我修復(fù)能力較差[8]，常導(dǎo)致各種畸形和功能障礙[9-11]。

目前，對于鼻中隔缺損常用的修復(fù)方法有人工假體植入、自體骨或軟骨移植等[4]。但均存在一定的缺陷。1987年Vacanti等[12]提出組織工程的概念，利用組織工程學(xué)研究和開發(fā)修復(fù)組織損傷和改善功能的生物替代品有了飛躍性的發(fā)展。軟骨組織工程是指應(yīng)用細胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，將適宜的種子細胞培養(yǎng)擴增后，種植于生物支架材料，用以修復(fù)軟骨缺損[12-13]。Puelacher等[14]曾利用牛軟骨細胞在裸鼠皮下構(gòu)建了鼻中隔軟骨，但其僅限于軟骨形狀以及透明軟骨組織成分上的研究，并未用于體內(nèi)修復(fù)。理想的種子細胞應(yīng)取材方便、來源廣泛、對供體損傷少、具有良好的增殖能力，且植入體內(nèi)后不會引起免疫反應(yīng)[15-16]。研究證實，BMSCs復(fù)合生物支架材料能夠有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，相較軟骨細胞，BMSCs能在各種關(guān)節(jié)微環(huán)境內(nèi)分化成軟骨細胞和成骨細胞，而且在誘導(dǎo)分化成軟骨細胞的過程中，對糖氨多糖和特異性細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的表達能力高于ADSCs[17-19]。負重部位因為存在生物力學(xué)的刺激作用，所形成軟骨組織的功能和結(jié)構(gòu)更加優(yōu)良，這不僅說明軟骨微環(huán)境對于形成良好軟骨組織非常重要，更指出BMSCs構(gòu)建軟骨組織的可行性。本研究中，我們經(jīng)由淋巴細胞分離液（Percoll分離液）來分離提取兔骨髓中的單個核細胞，再進行體外培養(yǎng)。此方法分離后獲得的BMSCs純度較高，且操作快捷、簡便，對細胞活性的影響小。

組織工程支架材料應(yīng)具有三維多孔結(jié)構(gòu)、良好的生物降解性和相容性，介導(dǎo)細胞在其表面的黏附、增殖，并提供良好的微環(huán)境讓細胞在其表面生長、增殖、分泌基質(zhì)。作為支撐和負重的結(jié)構(gòu)，也應(yīng)具有良好的機械強性和可塑性[20]。除了將現(xiàn)有材料交聯(lián)配合使用外，探索新的支架材料是組織工程研究的重要方向。3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物（Poly-3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate，PHBV）是生物可降解高分子材料，其最終降解產(chǎn)物為H2O和CO2[21]。此支架材料用PHBV為基體，添加玉米、土豆等各類含纖維素淀粉類物質(zhì)，相較天然高分子材料，具有良好的機械性和韌性；且PHBV屬于天然原料合成，無化學(xué)添加劑，不產(chǎn)生生物毒性，具有良好的組織相容性。總之，PHBV作為支架材料具有多孔的三維結(jié)構(gòu)、良好的機械強度、良好的親水性、獨特的電壓性和良好的生物相容性[22]。本實驗中，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)材料表面的細胞不僅伸展黏附良好，并分泌細胞外基質(zhì)，表明PHBV支架具有良好的細胞相容性。

兔正常鼻中隔軟骨的主要營養(yǎng)來源是軟骨膜，故其自我再生修復(fù)能力低。研究表明，大于4 mm的關(guān)節(jié)軟骨全層缺損一般不能自我修復(fù)，缺損部位由纖維結(jié)締組織填充[23]。兔是鼻部研究的主要動物模型。兔的鼻中隔結(jié)構(gòu)由四邊形鼻中隔軟骨、犁骨、篩骨垂直板構(gòu)成，鼻腔的解剖結(jié)構(gòu)、形狀大小與人類基本相似，具有動物實驗?zāi)Ｐ徒⒌目尚行訹7]。本次研究于兔鼻中隔軟骨建立1 cm×0.5 cm左右的缺損模型，不破壞鼻中隔軟骨周圍組織。

實驗中，軟骨缺損區(qū)分別植入BMSCs-PHBV復(fù)合物及單純PHBV支架材料，并在術(shù)后16周和24周取出鼻中隔軟骨。經(jīng)由大體標本觀察可知，實驗組新生的軟骨組織填充軟骨缺損部位，新生組織與周圍軟骨分界不明顯，結(jié)合良好?？瞻捉M則未有軟骨樣組織修復(fù)，表面纖維結(jié)締組織增生嚴重。

組織學(xué)染色示有透明軟骨樣組織形成，可見完整軟骨陷窩，內(nèi)有細胞核，周圍有藍染的細胞外基質(zhì)沉積，細胞密度均勻，細胞排列規(guī)則平整。單獨植入PHBV支架的對照組新生軟骨薄，且新生軟骨組織和正常軟骨組織分界明顯，不能完整修復(fù)，表面覆蓋纖維結(jié)締組織。組織學(xué)染色可見纖維結(jié)締組織填充，軟骨陷窩結(jié)構(gòu)幼稚，中空現(xiàn)象明顯。Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組和實驗組的新生組織中軟骨陷窩逐步成熟，細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原含量逐漸增多。相較于對照組，實驗組新生軟骨組織的軟骨結(jié)構(gòu)也更為成熟，細胞外基質(zhì)表達強烈，細胞密度均勻、排列規(guī)則，與周圍正常組織界限不明顯。

綜合上述，BMSCs可在PHBV支架上黏附伸展，向軟骨細胞分化，合成細胞外基質(zhì)。此外，支架結(jié)構(gòu)基本降解，未見明顯的炎性浸潤，表明PHBV支架材料在兔體內(nèi)的生物相容性良好。今后我們將對新生軟骨組織進行生物力學(xué)特性檢測，進一步探索BMSCs-PHBV復(fù)合物的應(yīng)用效果，為修復(fù)鼻中隔缺損提供新的策略。

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BMSCs-PHBV in the In-situ Remediation of Nasal Septal Defect in Rabbit

CHEN S iq i,WANG Jian.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth people's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:WANG Jian(E-mail:doctorwangj@hotmail.com).

Objective To explore the feasibility of the in-situ remediation of nasal septal defect in rabbit by BMSCs combing PHBV.Methods The nasal septal defects were surgically created in the 36 rabbits.The rabbits were randomly divided into 3 groups according to the repair materials.The experimental group:BMSCs-PHBV complex;the control group: only PHBV;the blank group:nothing.The specimen in each group were harvested for gross observation,HE and immunohistochemistry staining 16 and 24 weeks after operation.Results The defects were repaired by the hyline-like cartilage tissue without obvious boundary in the experimental group while the defects were repaired by thinner cartilage tissue with obvious boundary in the control group.And the defects were repaired by the fibrous tissues in the blank group. Histology and immunohistochemistry demonstrated that the cartilage formed have more compact tissue structure in the experimental group.The cartilage matrix staining of cartilage formed in the experimental group were stronger than that of cartilage formed in the control group.Conclusion BMSCs-PHBV complex could repair defects of nasal septal cartilage in rabbits effectively.

Nasal septal cartilage;Bone marrow stroma stem cells;Regenerative Medcine;In-situ remediation

R765.3，Q813.1+2

A

1673－0364（2015）01－0001－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.01.001

2014年10月8日；

2014年12月10日）

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

王?。‥-mail：doctorwangj@hotmail.com）。