粘桿菌素流加補(bǔ)糖發(fā)酵工藝研究

李為全,王 洲

(1．安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司,安徽宿州 234000; 2．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

粘桿菌素流加補(bǔ)糖發(fā)酵工藝研究

李為全1,王 洲2

(1．安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司,安徽宿州 234000; 2．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

粘桿菌素發(fā)酵老工藝發(fā)酵周期短,發(fā)酵單位比較低．研究了流加補(bǔ)糖新工藝,通過(guò)發(fā)酵過(guò)程流加葡萄糖,解除了物料濃度過(guò)高抑制粘桿菌素合成速率的問(wèn)題．同時(shí)結(jié)合對(duì)發(fā)酵接種量、培養(yǎng)溫度等參數(shù)的優(yōu)化,使粘桿菌素發(fā)酵單位由110 000 U/m L提高至520 000 U/m L,并把該工藝成功地運(yùn)用到生產(chǎn)中．

粘桿菌素;流加補(bǔ)料;發(fā)酵

粘桿菌素是由多粘類芽胞桿菌(Bacilluspolymgxa)產(chǎn)生、多種氨基酸和脂肪酸組成的一種堿性多肽類抗生素,對(duì)革蘭氏陰性桿菌有強(qiáng)烈的殺菌作用．由于粘桿菌素具有較好抗菌譜和高效(大多數(shù)菌株最小抑菌濃度＜6．25 ug/m L)、低毒、殘留少的特性,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖畜牧業(yè)[1-2]．

粘桿菌素發(fā)酵老工藝一般采取37℃高溫培養(yǎng)的方式．由于培養(yǎng)溫度比較高,發(fā)酵過(guò)程菌體衰老較快,導(dǎo)致發(fā)酵周期一般較短;發(fā)酵老工藝采取基礎(chǔ)料一次性加入,發(fā)酵基礎(chǔ)物料濃度比較高,消毒過(guò)程不好控制,特別是對(duì)淀粉的液化程度的控制不好把握,淀粉的濃度高,發(fā)酵過(guò)程菌體的代謝速率慢,發(fā)酵過(guò)程起步效價(jià)相對(duì)較低,每天單位增幅小,發(fā)酵結(jié)束時(shí)由于菌體的活力減弱,料液中殘留的糖濃度高,料液粘稠,提取難度大,提取出的產(chǎn)品純度達(dá)不到高端客戶的需求．為解決這個(gè)問(wèn)題,對(duì)老的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化．主要思路是通過(guò)發(fā)酵基礎(chǔ)配方的調(diào)整,降低了發(fā)酵基礎(chǔ)配方中碳源的濃度;采取發(fā)酵過(guò)程流加補(bǔ)入葡萄糖的方式[3-4],提高了發(fā)酵過(guò)程生物合成速率;通過(guò)對(duì)發(fā)酵接種量、培養(yǎng)溫度的優(yōu)化,提高了發(fā)酵起步效價(jià)和延長(zhǎng)了生產(chǎn)合成周期,提高了發(fā)酵放罐時(shí)的產(chǎn)物濃度;放罐發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度的提高非常有利于提取產(chǎn)品質(zhì)量的提高和成本的降低．該工藝已被應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中,提高了產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力．

1 材料和方法

1．1 菌株來(lái)源

出發(fā)菌株sy-7,由安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司保存使用．搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)能力測(cè)定平均效價(jià)為76 000 U/m L．

1．2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5、KH2PO41、蛋白胨1．5、酵母膏1、瓊脂20,p H 7．0．

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨4、酵母膏1、NaCl 2、CaCO34,p H 7．0～7．2．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):淀粉濃度20、蛋白胨30、(NH4)2SO410、小麥胚芽粉15、NaCl 10、KH2PO40．6、CaCO36,p H 6．5～6．8．

葡萄糖液濃度:50%．

1．3 分析方法

發(fā)酵效價(jià)測(cè)定:發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心10 min,取上清液采用HLPC測(cè)定粘桿菌素含量[5]．菌體形態(tài)檢查:美蘭染色,光學(xué)顯微鏡觀察法．總糖及還原糖的檢測(cè):蒽酮比色法[6]．游離氨基氮的檢測(cè):甲醛氧化測(cè)定[6]．

1．4 培養(yǎng)方法

培養(yǎng)條件:斜面、搖瓶種子及發(fā)酵培養(yǎng),溫度33℃;斜面培養(yǎng)周期3 d,種子培養(yǎng)周期28 h;搖瓶發(fā)酵裝液量100 m L/500 m L,轉(zhuǎn)速220 r/min,發(fā)酵周期48 h．不補(bǔ)料50 L罐發(fā)酵37℃培養(yǎng)48 h,補(bǔ)料50 L罐發(fā)酵33℃培養(yǎng)96 h．

流加補(bǔ)糖發(fā)酵工藝:流加補(bǔ)糖發(fā)酵培養(yǎng)溫度經(jīng)試驗(yàn)摸索采用33℃培養(yǎng),發(fā)酵周期為4 d．發(fā)酵過(guò)程流加補(bǔ)入葡萄糖液,采用蠕動(dòng)泵壓入．

補(bǔ)糖速率:根據(jù)發(fā)酵液殘?zhí)堑臐舛?控制補(bǔ)入糖液;通過(guò)氨水自控補(bǔ)入,控制p H 6．0±0．05．

2 結(jié)果與討論

2．1 流加補(bǔ)糖速率控制及發(fā)酵過(guò)程還原糖濃度控制

老工藝發(fā)酵過(guò)程不補(bǔ)料,新工藝發(fā)酵采取流加補(bǔ)糖工藝．發(fā)酵接種后,開(kāi)始流加補(bǔ)入葡萄糖,每12 h補(bǔ)入液糖速率為發(fā)酵初始體積的2%,8 h后隨著菌量增加,逐漸提高補(bǔ)糖速率,20 h后隨著菌體濃度增大,逐漸進(jìn)入生產(chǎn)期,每12 h補(bǔ)糖速率控制在3．6%,30 h后補(bǔ)糖速率達(dá)到最大;30～70 h,每12 h補(bǔ)糖速率在3．8%;70～90 h糖耗速率逐漸降低,相應(yīng)降低補(bǔ)糖速率．發(fā)酵過(guò)程根據(jù)發(fā)酵液總糖質(zhì)量濃度,適量調(diào)整補(bǔ)糖速率,一般控制發(fā)酵液總糖質(zhì)量濃度為0．3～2．0 g/100m L范圍比較好．

新、老工藝發(fā)酵過(guò)程總糖含量的變化如圖1所示．由圖1可以看出,老工藝發(fā)酵初始總糖為13%,發(fā)酵過(guò)程中糖質(zhì)量濃度逐漸下降,放罐時(shí)總糖質(zhì)量濃度為4%,比較高,不利于提取,造成浪費(fèi);流加補(bǔ)糖工藝發(fā)酵過(guò)程總糖質(zhì)量濃度在0．5%～2．5%之間,放罐時(shí)殘?zhí)菨舛缺容^低,有利于提取,同時(shí)也有利于減輕環(huán)保處理的壓力．

2．2 接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

老工藝和新工藝30 h起步效價(jià)比較如圖2所示．由圖2可以看出,不補(bǔ)糖粘桿菌素發(fā)酵工藝,接種量為1．0%,比較小,前期發(fā)酵起步效價(jià)比較低,發(fā)酵30 h發(fā)酵起步效價(jià)只能夠達(dá)到40 000 U/m L左右．采取流加補(bǔ)糖發(fā)酵工藝后,優(yōu)化了發(fā)酵接種量工藝,通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)增大發(fā)酵接種量可以明顯提高發(fā)酵起步效價(jià)和中期前的生物合成速率．通過(guò)小試罐工藝摸索確定發(fā)酵接種量為3%～5%,發(fā)酵起步效價(jià)比較高,發(fā)酵30 h起步效價(jià)可以達(dá)到100 000 U/m L．

2．3 發(fā)酵培養(yǎng)溫度的優(yōu)化及發(fā)酵周期的變化

老的生產(chǎn)工藝發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉濃度高,菌體的代謝速率比較低,發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃,發(fā)酵周期為40～60 h,發(fā)酵周期比較短．采取流加補(bǔ)糖工藝后,降低了基礎(chǔ)料淀粉的濃度,解除了基質(zhì)的抑制．在搖瓶中考察了不同培養(yǎng)溫度31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃對(duì)產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖3所示．由圖3可以看出,該菌種33℃下發(fā)酵單位最高,降低了發(fā)酵培養(yǎng)溫度,采取33℃培養(yǎng),菌體衰老變慢,菌體形態(tài)比較好,粘桿菌素的旺盛合成期明顯延長(zhǎng),整個(gè)發(fā)酵周期得到延長(zhǎng)．發(fā)酵過(guò)程由于采取流加補(bǔ)糖,使發(fā)酵液殘?zhí)翘幱诰w代謝的最適狀態(tài),滿足了菌體代謝需要,增大了發(fā)酵體積,發(fā)酵產(chǎn)量明顯提升．

2．4 不同發(fā)酵工藝粘桿菌素發(fā)酵單位比較

老工藝和新工藝發(fā)酵單位變化趨勢(shì)如圖4所示．不補(bǔ)料的老工藝基礎(chǔ)料淀粉質(zhì)量濃度為13%,一次性投入,淀粉濃度高,還原糖濃度高,發(fā)酵中、前期易產(chǎn)生高濃度基質(zhì),抑制菌體生長(zhǎng)和影響發(fā)酵過(guò)程粘桿菌素生物合成的啟動(dòng)．從圖4可以看出,發(fā)酵30 h效價(jià)為44 000 U/m L,發(fā)酵48 h發(fā)酵單位達(dá)到約115 500 U/m L,發(fā)酵周期延長(zhǎng)后單位不再增加,發(fā)酵單位比較低．流加補(bǔ)糖新工藝采取基礎(chǔ)料加入少量淀粉,發(fā)酵過(guò)程根據(jù)菌體代謝速率流加補(bǔ)糖,滿足菌體的代謝需求．發(fā)酵過(guò)程由于糖濃度可以控制在最適的范圍,促進(jìn)了菌體的代謝速率,過(guò)程合成速率明顯提高．發(fā)酵30 h發(fā)酵單位達(dá)到100 000 U/m L,發(fā)酵60 h發(fā)酵單位達(dá)到420 000 U/m L,發(fā)酵96 h發(fā)酵單位達(dá)到520 000 U/m L．發(fā)酵80 h后發(fā)酵單位增幅明顯變小,因此最佳發(fā)酵周期為4 d．

3 結(jié)論

以50 L發(fā)酵罐進(jìn)行粘桿菌素發(fā)酵工藝研究．粘桿菌素老的生產(chǎn)工藝,發(fā)酵基礎(chǔ)料中淀粉一次性加入,發(fā)酵過(guò)程不補(bǔ)糖,接種量比較小,培養(yǎng)溫度37℃,發(fā)酵周期為48 h,比較短,放罐效價(jià)低,生產(chǎn)上發(fā)酵單位只能達(dá)到110 000 U/m L,提取生產(chǎn)成本高,產(chǎn)品的質(zhì)量不高．而流量補(bǔ)糖發(fā)酵工藝,通過(guò)對(duì)發(fā)酵基礎(chǔ)配方、流加補(bǔ)糖、培養(yǎng)溫度、接種量進(jìn)行了系統(tǒng)研究,發(fā)酵4 d,發(fā)酵單位達(dá)到520 000 U/m L,提高了粘桿菌素的發(fā)酵生產(chǎn)水平,降低了生產(chǎn)成本．

[1] 賴濱霞．粘桿菌素高產(chǎn)菌株的選育[J]．福建畜牧獸醫(yī),2010,32(6):19-20．

[2] 李德培．抗革蘭氏陰性菌促長(zhǎng)藥物-粘桿菌素[J]．獸藥與飼料添加劑,1999,4(1):21-24．

[3] 丁煜．用分批補(bǔ)加培養(yǎng)基研究林可霉素生物合成工藝[J]．國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),1996,17(1):21-23．

[4] 李繼安,林惠敏,牛金剛,等．流加補(bǔ)料技術(shù)在林可霉素發(fā)酵中的應(yīng)用[J]．中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012,43(9):739-740．

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典[M]．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2000．

[6] 王秀奇,秦淑媛,高天慧,等．基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．北京:高等教育出版社,2005．

Study on fermentation process of colistin by flow feed in sugar

LI Wei-quan1,WANG Zhou2
(1．Wan Bei Pharmaceutical Co．Ltd．,Suzhou 234000,China; 2．College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

The old fermentation process of colistin has the disadvantages of short fermentation period and low fermentation unit．This paper developed a new sugar supplement test for colistin and studied the fed sugar fermentation process of colistin．By using fed glucose fermentation process,the inhibition of colistin synthesis rate due to the high glucose concentration can be relieved．Combined with the optimization of fermentation inoculum and culture temperature parameter,the colistin fermentation unit can go up from 110 000 U/m L to 520 000 U/m L．And this technology has been successfully applied to large-scale production．

colistin;flow feeding;fermentation

Q815

A

1672-2477(2015)04-0017-03

2015-02-16

李為全(1975-),男,安徽宿州人,工程師,碩士．